Аппараты биотехнологического производства: амплификация гена in vitro.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Амплификаторы принцип работы. Денатурация. Отжиг. Элонгация. ПЦР в реальном времени. Оборудование для ПЦР в реальном времени. Процесс амплификации с использованием OmniMix HS.

Полимера́зная цепна́я реа́кция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биотехнологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). Помимо простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биотехнологической практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов.

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20-40 тысяч пар нуклеотидов. Это всё равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд пар оснований.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта», Touchdown ПЦР и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C. Для ПЦР в реальном времени выпускают приборы, оборудованные флуоресцентным детектором. Существуют также приборы с автоматической крышкой и отделением для микропланшет, что позволяет встраивать их в автоматизированные системы.

Ход реакции

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий.

1. Денатурация. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96°C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин. для полной денатурации матрицы и праймеров.Такой приём называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

2. Отжиг. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4—5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5—2 мин. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре).

3. Элонгация. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7-10 мин.

ПЦР в реальном времени. В настоящее время внедряется новая технология ПЦР — ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). Ее принципиальной особенностью является мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции и автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Этот метод не требует стадии электрофореза, что позволяет снизить требования, предъявляемые к ПЦР лаборатории. Благодаря экономии производственных площадей, уменьшению количества персонала и востребованности количественного определения ДНК/РНК этот метод в последние годы успешно применяется в крупнейших научно-исследовательских центрах развитых стран мира, замещая ПЦР в ее сегодняшнем ("классическом") формате.

ПЦР в реальном времени использует флуоресцентно меченые олигонуклеотидные зонды для детекции ДНК в процессе ее амплификации. ПЦР в реальном времени позволяет провести полный анализ пробы в течение 20-60 мин и теоретически способен детектировать даже одну молекулу ДНК или РНК в пробе.

ПЦР в реальном времени использует TaqMan систему, контролирующую кинетику ПЦР непосредственно в ходе амплификации с использованием резонансного тушения флуоресценции. Для детекции используется зонд, несущий флуорофор и тушитель, комплементарный средней части амплифицируемого фрагмента. Когда флуорофор и тушитель связаны с олигонуклеотидным зондом, наблюдается лишь незначительная флуоресцентная эмиссия. Во время процесса амплификации за счет 5'-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы флуоресцентная метка переходит в раствор, освобождаясь от соседства с тушителем, и генерирует флуоресцентный сигнал, усиливающийся в реальном времени пропорционально накоплению амплификата.

Оборудование для ПЦР в реальном времени:

Амплификатор Mx3005P для ПЦР-анализа в реальном времени

Характеристика амплификатора Мх3005P:

источник возбуждения: кварцевая вольфрамовая галогеновая лампа, пятипозиционное колесо фильтров канала возбуждения,

детектор: одна сканирующая трубка - фотоумножитель (PMT), пятипозиционное колесо фильтров канала детекции,

амплификатор имеет 5 фильтров по выбору пользователя: пятипозиционное колесо каналов,

возбуждения и детекции - можно выбрать фильтры для детекции следующих красителей: ALEXA Fluor® 350 (350nm-440nm), FAM™/SYBR® Green I (492nm-516nm), TET (517nm- 538nm), HEX™/JOE™/VIC™ (535nm-555nm), Cy3™ (545nm-568nm), TAMRA™ (556nm- 580nm), ROX™/Texas Red® (585nm-610nm) и Cy5™ (635nm-665nm).

термоблок: твердотельный, основанный на технологии Peltier 96-луночный блок, формат образцов: 96-луночные планшеты, стрипы из 8 пробирок, пробирки 200 мкл, оптимальный объем образцов 25 мкл.

Встроенная система защиты данных в случае сбоев электропитания или поломки компьютера

Спецификация амплификатора Мх3005P

10 порядков чувствительности на линейном участке кривой амплификации

длины волны возбуждения: 350-750 нм

длины волны эмиссии: 350-700 нм

температурное единообразие: +/- 0.25°C при 72ºC

распознавание образцов с содержанием от 5 до 10 копий ДНК-мишени с точностью 99.7% выявление одной копии ДНК-мишени

скорость амплификации: 40 циклов количественной ПЦР завершаются за 90 минут, при использовании реагентов FullVelocity SYBR QPCR & QRT-PCR - 60 минут.

размеры амплификатора Мх3005P: 33 см x 46 см x 43 см, вес 20 кг Smart Cycler II производство «Cepheid»

Новейшая версия универсального и высокоэффективного термоциклера фирмы «Cepheid» с оптическй детекцией в режиме "реального времени" (Real Time PCR).

Количественный и качественный анализ продуктов реакции амплификации на экране дисплея.

Продукты амплификации могут быть исследованы без вскрытия пробирок с амплификационной смесью, что устраняет возможность контаминации. Метод флюоресцентной регистрации продуктов амплификации позволяет количественно оценивать результаты в ходе ПЦР.

Smart Cycler II состоит из 16 независимых модулей I-CORE (Intelligent Cooling/heating Optical REaction), каждый из которых способен поддерживать заданный температурный режим. Системное обеспечение позволяет одному или нескольким исследователям проводить независимо друг от друга эксперименты с различными протоколами ПЦР, критериями оценки результатов ПЦР и анализом данных.

Высококачественная оптическая система в сочетании с продвинутым программным обеспечением обеспечивают мультиплексный количественный анализ позитивных и негативных результатов ПЦР. Smart Cycler II включает все оборудование и программное обеспечение, необходимое для получения результатов в режиме "реального времени": процессор, систему ввода информации CDSW, настольный компьютер, монитор, программное обеспечение (версия 2,0), панель управления и набор аксессуаров, состоящий из мини-центрифуги, штативов для пробирок и охлаждающего штатива, приспособленного для пробирок Smart Cycler.

Возможна также конфигурация "laptop".

Технические характеристики

Термоблоки Одновременного могут быть использованы от 1 до 6 блоков, каждый на 16 ячеек. Объем кюветы 25 и 100 мкл Пользовательский интерфейс Вывод на дисплей в режиме "реального времени" кривых роста концентрации ДНК и температурных профилей Простой графический формат позволяет быстро вводить протоколы. Автоматический переход к следующей стадии ПЦР по достижении установленного опереатором уровня. Получение результатов в "реальном времени". Хранение и импорт стандартных протоколов. Анализ данных Количественный и качественный анализ Первичный анализ по кривой роста количества ДНК и вторичный - по анализу продуктов реакции. Мультиплексный анализ с использованием внешнего контроля. Экспорт данных в виде JPEG Экспорт данных в Microsoft Excel Постоянный доступ пользователя к протоколу, графике и данным. Скорость нагревания (max.): 10 °C/сек от 50 °C дo 95 °C Скорость охлаждения (max.): 2.5 °C/сек от 95 °C до 50 °C

Температурная точность: ± 0.5 °C от 60 °C до 95 °C

Размеры Рабочий блок: 305 x 305 x 254 см Вес 8,8 кг Требования к электропитанию 100-240 V, 50-60 Hz, 350 Wt

Процесс амплификации с использованием OmniMix HS Готовые для использования лиофилизованные гранулы, содержащие компоненты для PCR, включая "hot start"-Taq полимеразу, для использования в системе Smart Cycler® Механизм "hot start" "Hot start"-продукт содержит специфичные к Taq-полимеразе моноклональные антитела для минимизации эффекта от неспецифичного связывания праймеров с ДНК-матрицей и образования праймерами димеров до начала первого цикла амплификации. Состав: OmniMix™ HS содержит все необходимые для ПЦР реагенты, кроме праймеров и флуоресцентных зондов или интеркалирующего красителя. Готовность к использованию: Не требует дополнительного времени для активации. Специфичность: Уменьшение образования неспецифического продукта и, как следствие, более качественная детекция. Простая постановка ПЦР с использованием OmniMix Предельное упрощение постановки ПЦР при использовании OmniMix HS. Исключены стадии добавления в образец растворов отдельных ингредиентов, что снижает риск контаминации и делает результаты практически стопроцентно воспроизводимыми.

Стабильность: OmniMix HS - это лиофильно высушенная смесь реактивов в виде гранул, стабильных при 2-8°C. Масштабирование: каждая пробирка 0.5 мл содержит содержит оптимальное количество OmniMix для постановки 2-х реакций амплификации в объеме 25 мкл. Для ПЦР в большем объеме можно использовать несколько гранул. Воспроизводимость: применение OmniMix позволяет легко получать прекрасно воспроизводимые результаты. Последовательность действий при постановке ПЦР с использованием OmniMix:

Новый мир возможностей генетического анализа. Системы генетического анализа – сиквенаторы (рисунок 6) CEQ 8000, CEQ 8800 и GeXP относяться к Cемейству приборов GenomeLab™. Системы генетического анализа созданы на основе технологии капиллярного электрофореза и включают в себя все наилучшие качества капиллярной технологии Beckman Coulter. Благодаря интегрированному программному обеспечению, высокой производительности, точности, специальной химии, использованию высококачественных капилляров, специальному гелю, системы CEQ8000, CEQ8800 и GeXP являются мощным инструментом анализа и передовой разработкой современного аналитического приборостроения.

Литература:

Основная – 4 [55-67].

Дополнительная – 6 [191-201].

Контрольные вопросы:

1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2. Принцип работы амплификаторов.

3. Денатурация. Отжиг.

4. Элонгация. ПЦР в реальном времени. Оборудование для ПЦР в реальном времени. 5. Процесс амплификации с использованием OmniMix HS.

Лекция №6.

Требование к оборудованию процессов в биотехнологии и методы их усовершенствования.

Число используемых процессов в биотехнологии достаточно велика. В зависимости от вида процесса, применяемых сырья и культуры микроорганизмов используется различные оборудование (исходя из предъявляемых требований к аппаратуре). Для проведения анаэробных биотехнологических процессов (производство этанола, органических кислот, некоторых вакцин и др) не требуется подачи воздуха в аппарат, обычно не надо интенсивно перемешивать среду, а ряде случаев отпадает необходимость соблюдать асептические условия культивирования (культивирование дрожжей).

Для осуществления аэробных процессов производств а биологически активных веществ (антибиотиков, аминокислот, ферментов, антигенов, некоторых вакцинных препаратов), напротив, необходимо обеспечить интенсивную аэрацию и перемешивание культуральной жидкости, соблюдать строго асептические условия, решить сложные вопросы пеногашения и т.д. Поэтому возникает стерилизовать поступающий на биопредприятие и в аппаратуру воздух, зонировать помещения, стерилизовать приборы и аппараты.

Чтобы процесс культивирование микроорганизмов проходил продуктивно, необходимо соблюдать следующие правила:

1. Обеспечить подвод кислорода к клеткам и отвод образующегося диоксида углерода из культуральной жидкости (аэробы).

2. Интенсивно перемешать культуральную жидкость для её гомогенизации, обеспечение доступа жидких и газообразных субстратов ко всем клеткам, для удаления застойных зон в среде.

3. Осуществлять стерилизацию биореактора и связанных с ним коммуникаций, обеспечить асептические условия проведения процесса культивирования.

4. Иметь системы контроля за ходом культивирования, необходимые для реализации процесса ферментации (регулярный отбор проб и определения концентрации микроорганизмов для продуктов микробного синтеза и др).

С учётом этих требований, а также особенностей конкретных процессов разработано большое число конструкций аппаратов для культивирования.

Оборудование для биотехнологической промышленности изготавливают из высоколегированных марок нержавеющей стали, что в значительной степени оправдано (рисунок 3).

Внутренняя поверхность стенок биореактора, применяемого для глубинного культивирования микроорганизмов в стерильных условиях, должна бать тщательно отполировано, желательно до зеркального блеска. Наличие грубообработанных стенок может привести к загрязнению культуры посторонней микрофлорой, особенно в условиях непрерывного культивирования, длящегося до 30 и более суток.

Трубопроводы, подводимые к биореакторам и др. аппаратам, с которым они технологически связаны, должны располагаться системно и обеспечивать возможность их раздельной стерилизации.

Конструктивное оформление биореактора определяется также выбранным способом отвода тепла. Известно, что в зависимости от природы микроорганизма и стадии его развития изменяется количество выделяемого тепла.

Выбор или разработка биореакторов осуществляется исходя из их назначения. Для исследовательских целей выбираются аппараты с универсальной системой перемешивания, для промышленных целей – специализированные. Исследовательские уствановки выпускаются практически в каждой стране с развитой биотехнологией. В литературе (6 доп) представлены основные группы наиболее сложных аэробных глубинных ферментаторов и приведены их основные характеристики, на основе которых, в зависимости от свойства применяемых биологических агентов, может быть сделан предварительный выбор аппарата. Неотъемлемым элементом ферментаторов является система пенорегулирования.

После предварительного выбора принципиальной конструкции аппарата, основываясь на знании тонкостей технологии биосинтеза, особенностей биотехнологических процессов, на производственном опыте, даже на традиции, проводятся расчеты механической прочности, поверхностей теплопередачи, аэрационных устройств, сечений технологических подводов/отводов, производительности и др., имеющие многообщего с таковыми для химических реакторов, а также аппаратов в пищевой промышленности. Для практического выбора (разработки) биореактора весьма сложную задачу представляет идентификация условий аэрации и перемешивания для проектируемого процесса и их конструктивное обеспечение путем выбора (проектирования) внутренних конструкций аппарата.

Выбор и типа конструкции биореактора зависит от пенообразующих свойств среды и способа пеногашения. Под влиянием жиров и др. химических пеногасителей значительно изменяется проницаемость цитоплазматической мембраны, ухудшается обмен веществ, что в свою очередь приводит к ингибированию биосинтеза. Поэтому стремление к полной или, если это невозможно хотя бы частичной замене химических средств пеногашения механическими, что влечет за собой конструктивное изменения аппарата.

Применение эффективных механических способов пеногашения без добавления химических пеногасителей усложняет конструкцию аппарата, но при этом значительно снижает расход дефицитных жиров и одновременно интенсифицирует биосинтез.

Значение процесса аэрации культуральной жидкости не ограничивается лишь доставкой О2 в клеткам. В последнее время все большее внимание исследований уделяется вопросам десорбции газообразных продуктов метаболизма и, прежде всего, диоксида углерода. Установлено, что лимитирующим фактором при культивировании может быть не массообмен по кислороду, а недостаточная интенсивность десорбции газообразных продукции метаболизма. В частности, предполагается наличие как минимальной, так и максимальной критических концентраций СО2.

Процесс аэрации неизбежно сопровождается перемешиванием культуральной жидкости. Однако этот процесс неизбежно связан с механическим воздействием на клетки. Последствия этого воздействия могут быть благоприятными, если наблюдается разрушение конгломератов (гранул) клеток, и вредными, если наблюдается разрушение или повреждение клеток.

Следовательно, для каждого контрольного процесса культивирования перемешивание лимитирует процесс по одному из следующих трёх направлений:

1. Массопередача газ-жидкость (создание одинаково высокой турбулентности питательной среды по всему объему аппарата не удаётся, поэтому стремится к тому, чтобы вся жидкость прошла через зоны, где турбулентность наиболее интенсивна).

2. Массапередача жидкость-клетка (определяется перемешиванием в околоклеточной зоне и зависит от размеров клетки).

3. Механическое воздействие на клетку (зависит от срезывающих усилий, возникающих в жидкости из-за градиента скорости (сдвига). Количественно срезывающие условия обычно характеризуются окружной скоростью лопасти мешалки).

Культуральные жидкости являются классическим примером жидкости, которая хорошо пенится.

Пенообразование при проведении аэробного процесса культивирования, следует отнести к категории вредных явлений, осложняющих ведение процесса, поскольку:

- образование пены ведёт к уменьшению коэффициента заполнения культиватора;

- увеличиваются потери из-за уноса культуральной жидкости; - затрудняется борьба с загрязнениями и могут выйти из строя фильтры для очистки аэрирующего воздуха;

- пенообразование ухудшает условия снабжения микроорганизмов О2, питательными веществами и отвода продуктов метаболизма.

Для регулирования уровня пены при культивировании микроорганизмов и предотвращения её выброса из биореактора используют различные методы. Их можно разделить на пять групп.

1. Воздействие на пену химическими и физико-химическим средствами; использование питательных сред с пониженными пенообразующими свойствами; добавление ПАВ, уменьшающих прочность плёнок пены.

2. Разрушение пены механическими, гидро- и аэродинамическими способами; ударное воздействие поверхностей деталей и элементов; воздействие жидкости или газа; сепарирование пены инерционными, центробежными и другими методами; лёгкое изменение давление газа в пене; захват и разрушение пены потоками перемешиваемой жидкости.

3. Разрушение пены при физических воздействиях: колебания звуковой и ультразвуковой частоты; термическое пеногашение острым паром или при помощи нагретой жидкости; электрическое пеногашение.

4. Стабилизация уровня пены путём временного уменьшения расхода аэрирующего воздуха, отключение механической мешалки, вывода избыточной пены из аппарата.

5.Комбинированные воздействия. На практике применяются в основном химические и механические способы пеногашения, а также их сочетания.

Механические устройства для пеногашения бывают двух типов - вращающиеся и неподвижные (статические).

Действие вращающихся механических устройств для пеногашения основано на разрушении пузырьков пены при контакте с их рабочими поверхностнями. Одна из простейших и наиболее характерных конструкций механического пеногасителя – гладкий диск, вращающийся с большой скоростью над поверхностью пены.

Комбиноированные системы автоматического пеногашения позволяет наиболее эффективно регулировать уровень пены в ферментаторе при минимальном расходе электроэнергии и химического пеногасителя. Стабильность уровня пены обеспечивает наиболее благоприятные условия для снабжения микроорганизмов О2 и отвода СО2.

Аппаратурное оформление технологических стадий производства противовирусных вакцин существенно отличается от аппаратурного решения производства противобактерийных вакцин в силу своей строгой специфичности.

Часть гормональных препаратов предпочтительнее производить в культурах клеток (гормоны, имеющие 50 – 200 аминокислот). Используемые среды для систем клеток животных могут быть сложными (60 компонентов и более) В то же время исследователи располагают пока ещё недостаточной информацией о том, что и как генерирует растущая клетка, и что и как она секретирует в окружающую среду. Поэтому пока трудно сказать, какая конкретно требуется новая среда, но она должна быть дешевле существующих, проще в изготовлении и применении, содержать меньшее число компонентов, обладающих большей химической определенностью, и отличаться большей универсальностью.

Существуют два основных подхода к созданию необходимого оборудования. Первый подход предполагает создания оборудования, предназначенного для ведения в оптимальных условиях только данного специфического процесса. Второй подход заключается в том, чтобы сконтруировать многоцелевое оборудование, способное выполнять любой вид работы из заданной программы.

Примером первого подхода может служить создание аппаратуры для производства клеток животных, способных к генерированию целевых продуктов.

Альтернативная методология, предусматривающая иммобилизацию клеток на поверхности элементов насадочного слоя, заключается в содержании клеток внутри пористых матриц. Такие системы были проверены в аппаратуре для производства антител из гибридомных клеток.

Разрабатывается аппаратура, позволяющая осуществлять гомогенное или квазигомогенное культивирование клеток животных (т.е. на микроносителях) в масштабах от 100 до 1000 л; с его помощью можно выращивать клетки животных (включая гибридом) в суспензии. Незначительная модификация (ввод воздуха и установка мешалки с приводом) приводит к тому, что данное оборудование становится пригодным для производства бактерий, дрожжей и грибов. В принципе, в таком оборудовании можно производить и культуру клеток растений.

Однако, во всех случаях отбор оборудования необходимо производить с учётом показателей, характеризующих его эксплуатационно-производственные качества, сопоставимые с оборудованием альтернативных систем, например: эрлифтные и башенные или колоночные биореакторы, аппараты с тяговыми трубами и др. В этом состоит суть технологической оценки конкурирующих аппаратов. Как и в других областях биотехнологии, в области культивирования клеток животных и получения из них целевых продуктов невозможно увеличить размер рабочего оборудования без изменения его основных геометрических свойств и массообменных характеристик (отношение жидкости к её объему и вводимой мощности к объему жидкости, а также коэффициента массопередачи кислорода).

Для оптимизации работы оборудования и процессов необходим монтаж в рабочем схеме соответствующих датчиков локальных и управляющих компьютеров, а также электронно-вычислительных машин. Основной целью оснащения биологических процессов современными оборудованием, техническими средствами механизации и автоматизации является повышение производительности и качества биопрепаратов, охрана труда и вопросы экологии. Широкое привлечение в биотехнологии методов математического моделирования, оптимизации, масштабирования, реализации системного подхода с использованием экономико-математических методов автоматизации и методов кибернетики придало этому направлении своеобразные черты, обусловленные характером технологии, подчиненностью потребностям и специфики живых объектов и своеобразными чертами экономики биотехнологических процессов и их аппаратурного оформления.

Литература:

Основная – 3 [74-81]; 4 [78 85].

Дополнительная – 6 [191-201].

Контрольные вопросы:

1. Требования к оборудованию биотехнологических процессов.

2. Чем определяется конструктивное оформление биореактора?

3. Пенообразование, пеногашение, сущность процессов.

4. Перспективные направления в области создания современного оборудования для биотехнологических процессов.

 

 

Лекция №7.