Приготовление агаризованной питательной среды МС

Ход выполнения работы:

1. В химический стакан емкостью 2 л поместить 20 г сахарозы, долить дистиллированнй водой до 400 мл и растворить.

2. Добавить к раствору сахарозы 50 мл маточного раствора макросолей, 1 мл микросолей, 5 мл хелата железа, 5 мл хлористого кальция.

3. Приготовить агар: навеску 5 -7 г поместить в стакан и залить водой до 200 мл, растворить, нагревая на плитке или газовой горелке, при постоянном помешивании. Готовый агар долить к раствору солей.

4. Питательную среду довести до нужного объема (1л) дистиллированной водой. Измерить рН среды: если рН превышает 5,5 – 6,0 добавить несколько капель 0,1 н НСl, если ниже этого значения – 0,1 н КОН.

5. Готовую питательную среду разлить в пробирки на 1/3 объема, закрыть пробки ватными пробками, помесить пробирки в металлические штативы.

6. Штативы с пробирками завернуть в целлофановую бумагу (чтобы в автоклаве не открылись пробки).

7. Поместить штативы с пробирками в автоклав и проавтоклавировать.

Контрольные вопросы:

 

1. Питательные среды, их особенности, состав и применение.

2. От чего зависит выбор питательной среды?

3. Методика приготовления питательных сред для культивирования клеткок растений.

4. Какие вещества входят в состав питательных сред, и какую функцию они выполняют в культуре клеток и тканей in vitro?

5. Устройства для приготовления питательных сред.

6. Какой фактор влияет на нормальный рост и развитие растений в условиях in vitro и почему?

 

Лабораторная работа № 5

Подготовка растительного материала и изоляция эксплантов

Цель работы: изучить теоретические основы способов выращивания куллусных культур и освоить практические навыки работы по их выращиванию, в частности, ознакомиться с первыми этапами выращивания – подготовкой растительного и изоляцией эксплантов.

 

Теоретические основы

Получить стерильный материал из семян огурца и пшеницы селекционных образцов часто бывает достаточно трудно, что связано с необходимостью выбора стерилизующего агента. Наиболее распространены в культуре in vitro стерилизаторы, содержащие активный хлор: гипохлориты кальция и натрия в концентрации 35 г/л; стерилизующие растворы, содержащие ртуть (сулема и диацид), в концентрации 0,1 %; пероксид водорода в концентрации 10-12 %; антибиотики в концентрации 4-5 мг/л. Как правило, стерилизующее вещество должно обеспечивать наибольший процент неповрежденных тканей под семенной оболочкой, способных к росту и новообразованиям при наименьшем проценте инфекции. Продолжительность стерилизации эксплантов следует также тщательно подбирать.

Получение стерильных эксплантов состоит из трех этапов: предстерилизацией, стерилизацией и постстерилизацией.

Перед стерилизацией семена промывают на сите теплой проточной водой, затем помещают в марлевые мешочки, в которые кладут этикетки с указанием номера генотипа. После этого марлевые мешочки вносят в стерильный бокс, где последовательно проводят все операции по стерилизации. Стерильные проростки, полученные из семян, используют в дальнейшей работе для получения:

· эксплантов верхушечных меристем;

· первичного каллуса из тканей листьев, сегментов щитка и изолированных зародышей (пшеница).

Стерильные проростки выращивают с целью изолирования эксплантов для получения каллусной ткани или прямой регенерации растений. В зависимости от задачи опыта семена проращивают на воде или на агаризованной питательной среде.

Приборы и материалы: семена различных растений (20 шт.), стерильные чашки Петри с одним-двумя слоями фильтровальной бумаги, химические стаканы (3 шт.), пробирки, пинцеты, ножницы, марлевые мешочки, колбы на 250 мл со стерильной дистиллированной водой, 0,1 %-ный раствор сулемы, 96 %-ный спирт, спиртовка.

Ход выполнения работы:

Отбирают 10 здоровых, одинаковых по размеру семян, тщательно промывают в мыльном растворе, затем под проточной водой. Помещают в марлевые и в ламинар-боксе погружают на 10 с в 96 % спирт, затем в 0,1 % раствор сулемы или диацида на 10-15 минут. После этого семена промывают в 3-5 объемах стерильной дистиллированной воды и слегка подсушивают. Пинцетом раскладывают по 10 семян в чашки Петри на один-два слоя фильтровальной бумаги и добавляют по 10-15 мл стерильной воды, закрывают крышками. Подготовленные в чашках Петри объекты проращивают в термостате при 25 ^оС или в световой комнате в течение 2-3 суток. В рабочей тетради зарисовывают схему процесса стерилизации и заполняют таблицу, выполненную по форме 1, с указанием стерилизующего агента и экспозиции для стерилизации семян.

Форма 1

 

Характеристика методов стерилизации семян

Метод стерилизации	Стерилизующее вещество	Концентрация, % (мл)	Экспозиция, Мин и с	Цель стерилизации
Предстерилизация
Стерилизация
Постстерилизация

 

Приборы и материалы: семена подсолнечника, гороха, фасоли и др., стерильные чашки Петри, коническая колба на 300… 500 мл, дно которой покрыто ватой, смоченной водой, или фильтровальной бумагой, вода, химические стаканы (2 шт.), пробирки с питательной средой МС (1/2 нормы) без гормонов.

 

Ход выполнения работы

Отбирают 10 здоровых, одинаковых по размеру семын, тщательно промывают в мыльном растворе, затем водопроводной и дистиллированной водой. Помещают в марлевые мешочки и погружают на 1-2 минуты в 96 %-ный спирт, после чего стерилизуют 0,1 % -ным раствором сулемы или 3 % раствором хлорамина в течение 15 минут. Далее промывают в стерильной дистиллированной воде, сменяя ее 5-6 раз.

В ламинар-бокс с помощью стерильного пинцета раскладывают 10 семян в стерильную колбу на влажную вату или фильтровальную бумагу; мелкие семена (табака, моркови и т.д.) можно проращивать в чашках Петри на фильтровальной бумаге, обильно смоченной стерильной водой. Для получения стерильных проростков на агаризованной питательной среде МС в одну пробирку помещают по одному семени. Пробирки, колбы и чашки Петри с семенами ставят в термостат или в световую комнату на 5 дней, где поддерживают температуру 25 ^оС.

Контрольные вопросы:

1. Какие стерилизующие агенты вы знаете?

2. Методика получения стерильных эксплантов.

3. От чего зависит время экспозиции эксплантов?

Лабораторная работа № 6

Посадка и культивирование эксплантов на агаризованной среде

Цель работы: Изучить теоретические основы способов выращивания куллусных культур и освоить практические навыки работы по их выращиванию.

 

Теоретические основы

Культура изолированных тканей обычно представлена каллусными и гораздо реже опухолевыми тканями. Каллусная ткань образуется в результате повреждения на целых растениях, а также в стерильной культуре на эксплантах – фрагментах ткани или органа, используемых для получения первичного каллуса.

Каллусная ткань in vitro в основном бывает белого или желтоватого, реже светло-зеленого цвета. Очень редко она может иметь интенсивную зеленую окраску. Темно-коричневая окраска чаще всего появляется при старении каллусных клеток и связана с накоплением фенолов. Последние окисляются в хиноны. Для избавления от этих соединений в питательные среды вносят антиоксиданты. Каллусная ткань аморфна и не имеет конкретной анатомической структуры, но в зависимости от происхождения и условий выращивания она может быть разной консистенции:

· рыхлой, состоящей из сильно обводненных клеток, легко распадающейся на отдельные мелкие клетки;

· средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами;

· плотной, в которой дифференцируются элементы камбия и проводящей системы.

Обязательным условием дедифференцировки растительной клетки и превращения ее вкаллусную является присутствие в питательной среде представителей двух групп фитогормонов: ауксинов и цитокининов. Ауксины вызывают процесс дедифференцировки клетки, подготавливающий ее к делению, а цитокинины – пролиферацию(деление) дедифференцированных клеток.

Каллусная клетка в результате деления, которого возникла каллусная ткань или каллус, представляет собой один из типов клеточной дифференцировки, присущей всему растению. Для растения каллус является тканью, которая защищает место поранения, накапливает питательные вещества для анатомических структур или утраченного органа. Дифференцированные клетки объединяются в растении, в ткани и выполняют определенные функции. Клетки различаются не только функционально, но и морфологически.

На питательных средах с большим содержание ауксинов (2,4Д) клетки экспланта дедифференцируются и переходят к пролиферации. Особенности дедифференцировки клеток экспланта зависят от генетики и эпигенетики экспланта. Клетки утрачивают прежние функции и морфологию. Причем, чем меньше структурно и химически дифференцирована клетка, тем легче получить каллус. В клетке, готовящейся к делению, стимулируется синтез всех форм РНК, начинается репликация ДНК, исчезают специфические тканевые белки – антигены, синтезируются новые, специфичные для каллусных клеток. Меняется активность структурных генов и белкового аппарата клеток. Дедифференциация специализированных клеток начинается с обогащения их элементами цитоплазмы: микротрубочками, мембранами ЭПС и комплекса Гольджи, рибосомами, исчезают хлоро– и хромопласты, продукты их деятельности; может образоваться много ядер или увеличиться число хромосом; укрепляются вакуоли.

Каллус, выращиваемый поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенную структуру. Клетки каллуса либо бесцветны, либо имеют желтоватый оттенок. В зависимости от происхождения и условий культивирования различают каллусы: рыхлые, с сильно оводненными, легко отделяющимися друг от друга клетками; средней плотности, с зонами меристематической активности; плотные, с зонами редуцированного камбия и сосудов.

В биотехнологии, для отработки методик культивирования, чаще всего используют те виды растений, которые и в обычных условиях легко укореняются, регенерируют, образуют каллус. Поэтомубольшинство методов получения и культивирования каллуса разработано для табака. Каллусы можно получить практически из любой части растения, так как клетки табака легко дедифференцируются и переходят к пролиферации. Для культивирования каллусов из листьев табака используют среду Мурасиге-Скуга с добавлением ауксинов (2,4 Д).

Каллусы из различных органов пшеницы на искусственных питательных средах впервые были получены в 1968 году. Их можно использовать для изучения солеустойчивости, устойчивости к температурному стрессу, получения суспензий и протопластов.

Для индукции каллусогенеза обычно используют стерильные пробирочные растения, выращенные из зародышей на средах без гормонов.

Растения для получения каллусов можно вырастить в теплице. Для этого набухшие семена помещают на 5 недель в холодную камеру на яровизацию при 2^оС, проростки высаживают в вегетационные сосуды и выращивают до достижения молочною спелости. Незрелые зародыши выделяют и переносят на питательные среды.

Каллусы можно получать из разных частей растения, в том числе из кончиков корней. Образование каллуса происходит в области первичных и вторичных меристем. Процесс калусообразования зависит от размера экспланта. Оптимальная величина экспланта 5-10 мм³ и масса 20-100 мг.

Многие ткани имеют физиологическую полярность. Поэтому каллус лучше образуется на той стороне экспланта, которая ближе к апикальным меристемам корня. Кончики корней легко образуют каллус, если они помещены на среду горизонтально, тогда как сегменты стебля лучше формируют каллус, если их поместить вертикально.

Для культивирования на питательных средах лучше использовать стерильные корешки, полученные при проращивании семян в стерильных условиях.

Для культивирования стерильных проростков необходимо использовать ламинар – боксы, обеспечивающие посадку эксплантов на питательную среду без заражения микроорганизмов.

Все поверхности ламинара обрабатываются 96% спиртом, простерилизованные инструменты, материалы, растительный материал помещают на стол ламинара и включают УФ – излучение. Через 20 минут выключают УФ и включают биофильтры. Для работы в ламинар – боксе надевают стерильный халат и шапочку, руки обрабатывают 96% спиртом. Пинцеты, скальпели и препаровальные иглы помещают в стакан с 96% спиртом. Перед каждой манипуляцией инструменты обжигают на пламени спиртовки.