Приборы и устройства для культивирования клеток

Стерильность при работе с культурами клеток обычно достигается путем проведения исследования в так называемом боксовом помещении. Для создания боксовых помещений, как правило, необходимы значительные затраты. Альтернативой в этом случае является использование так называемых ламинар-боксов, или стерильных рабочих мест: в любом помещении может быть создан локальный стерильный объём, необходимый для работы и создающий биологическую защиту пользователей. Технически задачу решают путём постоянного, обдува места проведения работ (например, стола) ламинарным потоком воздуха, в 1 дм³ которого содержится не более 4 частиц загрязнителей величиной 0,3 — 0,5 мкм. Избыточное давление воздуха 5 рабочем объеме и специальные конструктивные меры исключают возможность попадания воздуха из помещения в то место, где расположен биологический материал. Ламинар-бокс с горизонтальным потоком обеспыленного воздуха типа УО-БГ, (установка обеспыливания биологическая с горизонтальным потоком) обеспечивает очистку воздуха, подаваемого в рабочую зону, до необходимого уровня. Очистку производят с помощью фильтров грубой и тонкой очистки, встроенных в прибор.

Ламинар-бокс типа БП-4-004 («Бокс-Р»), предназначенный для работ с потенциально патогенными культурами, обеспечивает подачу в рабочую зону ламинарного потока воздуха, в 1 дм³ которого содержится не более 3 — 4 частиц размером более 0,3 мкм. В приборе предусмотрена так называемая рециркуляция воздушного потока, заключающаяся в том, что воздух из рабочего объема попадает на специальный фильтр тонкой очистки, откуда часть его выходит в окружающее пространство, а остальной поток повторно проходит через фильтр тонкой очистки и вновь поступает в рабочий объем. Благодаря этому исключается вынос обрабатываемого материала в помещение. Возможность попадания выходящего воздуха на оператора предотвращают путем создания зоны подсоса на открытой стороне рабочего объема бокса. Перечисленные ламинар-боксы предназначены для размещения в любых производственных помещениях, имеющих приточную вентиляцию с предварительной грубой очисткой воздуха.

Лабораторные термостаты для культивирования клеток должны отвечать определенным требованиям: обеспечивать высокую стабильность заданной температуры, создавать минимальный градиент температуры по полезному объему, иметь систему быстрого восстановления температуры после кратковременного охлаждения. Внутренняя поверхность термостатов должна быть изготовлена из биологически пассивных материалов, т.е. не влияющих на жизнедеятельность клеток и стойких к воздействию компонентов питательных сред. Материалы, из которых изготавливают внутренние и наружные части термостата, и покрытия должны выдерживать деконтамиацию водными растворами спирта-ректификата и стерилизацию УФ-излучением.

Современные модели этих приборов имеют полезный объем от 20 до 1400 л. Полезный объем образуется полированными пластинами из нержавеющей стали или меди (у дорогих моделей). Как правило, термостаты имеют наружную и внутреннюю двери. Последнюю изготавливают из прозрачного материала, что позволяет наблюдать за содержимым термостата без нарушения температурного режима: Многие модели подобных приборов имеют секционную внутреннюю дверь, обеспечивающую доступ в термостат с минимальным нарушением теплового режима в полезном объеме. Температуру в рабочей камере термостатов обычно можно задавать в диапазоне от превышающей комнатную на 5 °С до 80 °С. В некоторых моделях термостатов имеется встроенная холодильная установка, позволяющая задавать температуру в диапазоне от -10 до 80 °С и поддерживать eё при помещении в полезный объем приборов, выделяющих дополнительное тепло, например роллерных установок, встряхивателей и т.п.

В связи с необходимостью поддержания постоянного рН питательной среды и ее минимального испарения в период инкубации клеток были созданы специальные приборы, предназначенные для этой цели, — так называемые углекислотные инкубаторы. По своей конструкции и основным параметрам они полностью соответствуют описанным выше термостатам. Основным отличием является наличие систем создания и поддержания определенного состава газовой среды в полезном объеме и высокой относительной влажности в нем.

В газовой среде камер углекислотного инкубатора повышена концентрация кислорода и углекислого газа, в большинстве случаев только углекислого газа; концентрацию задают в зависимости от условий культивирования и поддерживают автоматически с точностью до ±0,1 %. Современные модели этих приборов позволяют регулировать количество кислорода и углекислого газа в диапазоне от 1 до 95 об.%.

Известно, что принудительное перемешивание питательных сред с помещенными в них культурами клеток обеспечивает лучший газообмен и, следовательно, повышает эффективность культивирования. Во многих случаях этот эффект возрастает при сочетании перемешивания и поддержания температуры, oптимальной для данной культуры. Приборы, осуществляющие эту операцию, называются лабораторными встряхивателями. Конструктивно они состоят из платформы, на которой крепят сосуды, заполненные суспензией, и приводного механизма, обеспечивающего вращательное или возвратно-поступательное движение платформы. В случае необходимости платформу помещают в воздушный термостат; или водяную баню. Эти приборы относятся к сложным и дорогим техническим устройствам, что связано со специальными требованиями к их работе, основным из которых является строгое плоско-параллельное перемещение платформы без толчков и вибрации. Кроме того, при вращательном движении диаметр этого перемещения должен быть одинаков в любой точке платформы. Заданные параметры встряхивания (перемешивания) например радиус вращения, должны быть постоянными. Платформу приводят в движение с помощью электродвигателя через систему кинематических передач или путем приложения к платформе магнитного, поля.

Большинство современных приборов этого вида имеет следующие характеристики: частота возвратно-поступательных движений платформы 10 — 300 колебаний в 1 мин, частота вращательных движений платформы 40 — 400 об/мин, радиус вращения 20 - 25 мм, ход возвратно-поступательного движения 10—40 мм, стабильность поддержания, заданных параметров не менее ±1 % от заданной величины. Большинство моделей встряхивателей позволяет осуществлять перемешивание в одном режиме - вращательном или возвратно-поступательном. Наиболее современные модели являются универсальными, т.е. могут работать в любом из приведенных режимов перемешивания.

 

Материалы и оборудование: автоклав, сушильный шкаф, дистиллятор, ламинар-бокс, термостат, бактерицидная лампа, весы, химические стаканы (на 50, 100, 250 мл) штативы с пробирками, пипетки, колбы Эрленмейера, мерные цилиндры, чашки Петри, хлорамин, хромпик, моющие средства (стиральный порошок), инструменты (пинцеты, скальпели, препаровальные иглы).

Ход выполнения работы

1. Ознакомиться с устройством биотехнологической лаборатории.

2. Под руководством преподавателя освоить принципы работы автоклава, сушильных шкафов, дистиллятора.

3. Посуду тщательно отмыть в растворах детергентов (стиральный порошок), промыть 8 – 10 раз проточной водой, поместить на 2 – 3 часов в хромпик (смесь серной кислоты с бихроматом калия), промыть теплой водой, затем дважды дистиллированной и бидистиллированной.

4. Чистую посуду поместить в сушильный шкаф на 2 часа при температуре 100 – 130⁰С.

5. Сухую посуду для хранения закрыть ватными пробками, фольгой, целлофаном.

Контрольные вопросы:

1. Как устроена биотехнологическая лаборатория?

2. Как простерилизовать посуду, дистиллированную воду, инструменты, помещение лаборатории?

3. Организация лаборатории культуры ткани.

Лабораторная работа № 2