Изучение ферментативной активности бактерий для идентификации микроорганизмов

Каждый вид микроорганизмов характеризуется специфическим набором ферментов, в связи с этим определение ферментного спектра является важнейшим этапом идентификации микроорганизмов. О наличии ферментов судят по способности микроорганизмов воздействовать на определенный субстрат. Проявление ферментативной активности характеризуется изменением физического состояния субстрата (разжижение желатины), закислением питательной среды (среды Гисса с углеводами, среда Ресселя, среда Олькеницкого), образованием определенных продуктов метаболизма (индол, сероводород, аммиак) и т.д.

В идентификации видовой принадлежности особенно важное значение имеет определение у бактерий гидролаз и оксидоредуктаз. Группу гидролаз по действию на различные вещества практические микробиологи делят на сахаролитические, протеолитические, липолитические ферменты. Определение сахаролитических гидролаз (карбогидраз - ферментов, разлагающих углеводы) проводят с помощью биохимического ряда Гисса. Определение протеаз - ферментов, разлагающих белки, проводят обнаружением газов, являющихся конечным продуктом ферментации белков (индол, сеоводород, аммиак). с помощью специальных индикаторов. Липазы - ферменты разлагающие липиды, чаще всего определяют наличие лецитиназы посевом на желточный агар. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфохолин и диглицерид в этих случаях при росте колоний вокруг них появляются опалесцирующие зоны, отражающие лецитиназную активность.

Среди оксидоредуктаз различают оксидазы, пероксидазы, каталазы, дегидрогеназы. Определение последних имеет важное значение для дифференциации обширных групп родственных микроорганизмов (например, семейства Enterobacteriaceae).

Наиболее распространены следующие методы определения ферментативной активности микроорганизмов.

4. Методы определения гликолитической активности микроорганизмов

Сахаролитическиесвойства, т.е. способность расщеплять сахар и многоатомные спирты с образованием кислоты или кислоты и газа чаще всего изу­чают на дифференциально-диагностических средах Гисса, которые содержат питательный агар, тот или иной углевод и индика­тор Андреде (ВР или др.). В зависимости от изучаемого рода и вида бактерий подбирают среды с соответствующими моно- и дисахаридами (глюкоза, лактоза и др.), полисахаридами (крах­мал, гликоген и др.), высшими спиртами (глицерин, маннит и др.), в про­цессе ферментации которых образуются альдегиды, кислоты и газооб­разные продукты (С0₂, Н₂, СН₄).

В состав короткого “пестрого” ряда Гисса входит 5 углеводов: с глюкоза, лактоза, маннит, мальтоза и сахароза. При некоторых исследова­ниях для более углубленного изучения биохимических свойств выделенного микроба ряд Гисса дополняют дульцитом, сорбитом, ксилозой, арабинозой и некоторыми другими сахарами. Название “пестрый” ряд обусловлено тем, что под дей­ствием ферментов микроорганизмов одни углеводы остаются неизмен­ными и, следовательно, цвет питательной среды не меняет­ся, в то время как другие сахара расщепляются, образуя кислые продукты распада, которые изменяют цвет индикато­ра и соответственно цвет питательной среды. По консистенции среды Гисса бывают жидкими и полужидкими (с добав­лением 0,2—0,5% агар-агара). В пробирки с жидкими сре­дами Гисса для обнаружения газов, являющихся конечными продуктами распада сахаров, опускают “поплавок” — трубоч­ку диаметром 0,5—0,7 см, запаянную с одного конца. “По­плавок” помещают запаянным концом кверху; при стерили­зации он полностью заполняется питательной средой. При образовании в среде газообразных продуктов они вытесняют часть жидкости, находящейся в “поплавке”, вследствие чего у запаянного конца его собирается воздушный пузырек. В полужидких средах Гисса газообразование определяют по наличию мелких пузырьков газа в толще среды и стой­кой пены на ее поверхности. Таким образом, при изучении сахаролитических фермен­тов, выделяемых микробами, учитывают не только явления расщепления тех или иных сахаров по кислотообразованию, но и глубину ферментативного процесса по наличию в пита­тельной среде конечных газообразных продуктов. Пробирки с набором сред Гисса ставят в штатив в один ряд. На каждой пробирке надписывают название сахара, со­держащегося в среде. На первой пробирке каждого ряда, кроме названия сахара, указывают номер или вид исследуе­мой микробной культуры. Культуру берут на кончик петли в очень небольшом количестве и засевают по общепринятой методике.

Критерии учета результатов:

· цвет среды не меняется - культура не ферментирует углевод;

· цвет среды изменяется (в случае использования индикатора Андреде – со светло-желтого на красный, ВР – с розового на синий и т. д.) – культура ферментирует углевод с образованием кислых продуктов (органических кислот), пробирку отмечают буквой «К»;

· цвет среды изменяется и наблюдается появление пузырьков газа в среде или поплавке - культура ферментирует углевод с образованием кислых и газообразных продуктов. Такую пробирку отмечают буквами «КГ».

Кроме того, сахаролитическую активность изучают на средах Эндо, Левина, Плоскирева. Микроорганизмы, сбраживая до кислоты находя­щийся в этой среде молочный сахар, образуют окрашенные колонии (кис­лота изменяет цвет индикатора). Колонии микробов, не ферментирующих лактозу, бесцветны.

Таблица 17. Дифференциально-диагностические среды

Наименование и внешний вид среды	Состав (компоненты)	Назначение	Принцип действия и внешний вид среды после посева
Среда Эндо Бледно-розовая плотная сре­да, разливается в чашки Петри	Питательная основа-МПА, субстрат - лактоза, индикатор - основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия (Na2SO3)	Для рассева исследуемого материала (нативного или после обогащения) с целью получения изолированных колоний патогенных и условно-патогенных знтеробактерий: эшерихий, сальмонелл, шигелл, йерсиний и других	На среде можно наблюдать рост красных или бесцветных колоний. Эшерихии разлагают лактозу до кислых продук­тов, в том числе альдегидов, они соединятся с сульфитом натрия, при этом освобождается фуксии, который окраши­вает колонии и среду в красный цвет, часто с метал­лическим зеленоватым блеском (положительный результат). Сальмонеллы и шигеллы не разлагают лактозу и образуют бесцветные колонии (отрицательный результат).
Среда Левина Плотная среда красновато-фиолетового цвета. Среда является дифференциально-диагностической и слабо се­лективной, так как оказыва­ет ингибирующее действие на грамположительную микрофлору	Питательная основа-МПА, Субстрат - лактоза. Индикаторы - эозин и метиленовый синий	Для получения изолированных колоний патогенных и условно-патогенных энтеробактерий - см. среду Эндо. Среда Левина может быть использована также для выделения грибов Candida albicans	На среде можно наблюдать рост синих или бесцветных колоний. Escherichia coli, разлагающая лактозу, вызывает сдвиг рН в кислую сторону, при этом комплекс индикаторов эозина и метиленового синего выпадает в осадок и колонии приобретают темно-сине-фиолетовый, почти черный цвет, часто с металлическим блеском (положительный результат). Энтеробактерии не расщепляющие лактозу, образуют бесцветные колонии.
Среды Гисса Набор пробирок с полужидкой средой розового цвета.	Питательная основа - полужидкий МПА (0,4%), Субстрат (в каждой пробирке разный углевод), Индикатор - бром крезоловый пурпурный или BP (водный голубой и розоловая кислота)	Определение спектра сахаролитической активности с целью идентификации (определение родовой и видовой принадлежности) выделенной культуры бактерий семейства Enterobacteriaceae, а также других семейств и родов.	При ферментации субстрата образуются кислые продукты (молочная, уксусная, муравьиная и другие кислоты), кото­рые снижают значение рН и розовый цвет индикатора изменяется на синий, что указы­вает на положительную реакцию. При образовании газа (Н2 и СО2) - пузырьки и трещины в толще среды. Рост бактерий в среде Гисса без изменения ее цвета свидетельствует об отсутствии фермента, расщепляющего данный углевод, то есть об отрицательной реакции

5. Методы определения протеолитической активности бактерий

Протеолитическая активность микробов направлена на расщепление белков до промежуточных (пептоны, полипептиды, аминокислоты) или конечных (сероводород, индол, аммиак) продуктов. Действие протеолитических ферментов изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном.

Тест на желатиназу. Культуру микроорганизмов засевают уколом в столбик питательного бульона, содержащего 12% желатины. Посевы выдерживают при комнатной температуре (20-22°С) в течение нескольких (5-7) дней, при этом регистрируют не только наличие разжижения, но и его характер. Разжижение может быть послойным, что свойственно бактериям сине-зеленого гноя; холерный вибрион разжижает желатину в виде гвоздя; стафилококки – в виде чулка. Рост сибиреязвенных бацилл напоминает елочку, перевернутую вершиной вниз (характер разжижения послойный).

Тест на растворение свертка казеина. Культуру засевают на обезжиренное молоко. Культура расщепляет молочный сахар (лактозу) и за счет закисления среды наблюдается свертывание молочного белка (казеина). При выделении протеолитических ферментов казеин постепенно растворяется – пептонизируется, в результате чего молоко просветляется и приобретает легкий кремовый оттенок, а на дне пробирки формируется осадок.

Тест на свернутой кровяной сыворотке. Куль­туру исследуемых аэробных микробов засевают на чашки, анаэробных — уколом в столбик свернутой лошадиной сыво­ротки, инкубируют в термостате при 37 °С. Штам­мы, продуцирующие протеолитические ферменты, разжижая питательную среду, образуют углубления вокруг колоний или на поверхности столбика среды.

Некоторые виды патогенных микробов с выраженной про­теолитической активностью обладают способностью расщеп­лять белок и пептон до продуктов глубокого распада: индо­ла, сероводорода, мочевины и аммиака. При определении видов и дифференциации разновидно­стей патогенных микробов наибольшее значение имеет выяв­ление двух первых продуктов: индола и сероводорода.

Определение индола. Для обнаружения индола по спо­собу Мореля узкие полоски фильтровальной бумаги смачивают горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты и высушивают. Индикатор­ную бумажку помещают между стенкой пробирки с МПА и пробкой, предварительно произведя посев исследуемой культуры. При выделении индола на 2-3-й день нижняя часть полоски бумаги приобре­тает розовый цвет. Индол образуется при наличии у бактерий фермента триптофаназы при расщеплении сложной гетероциклической кислоты - триптофана.

Определение сероводорода. Сероводород яв­ляется конечным продуктом расщепления аминокислот: цистина, цистеина и метионина, содержащих серу. Петлю ис­следуемой культуры микробов засевают в пробирку с мясопептонным бульоном. Сероводород обнаруживают с помощью полоски фильтровальной бу­маги, пропитанной раствором ацетата свинца, которую закрепляют меж­ду стенкой засеянной пробирки и пробкой. При взаимодействии серово­дорода и ацетата свинца бумага чернеет в результате образования суль­фида свинца.

Тест на аммиак. Аммиак определяют при помощи увлажненной розовой лакмусовой бумажки, помещенной между стенкой и пробкой засеянной пробирки. Посевы инкубируют в термостате 1-5 суток. Посинение лакмусовой бумажки свидетельствует о выделении аммиака.