Определение гемотоксина (на МПА с кровью)

Золотистый стафилококк	Эпидермальный стафилококк

3. Вскрытие мыши. Инструменты стерилизуются кипячением. Труп мыши фиксируется на лотке с застывшим парафином брюшком кверху и дезинфицируется путем обжигания шерсти и кожи в области предполагаемых разрезов.

Делается продольный разрез кожи от лобка до нижней челюсти, а затем в стороны конечностей. После этого отсепаровывается кожа и изучается состояние подкожной клетчатки, лимфатических узлов, наличие кровоизлияний с помощью пинцета приподнимают слегка брюшную стенку и делают на ней надрез, после чего осторожно, чтобы не повредить кишечника, вскрывают брюшную полость. Изучают состояние внутренних органов брюшной полости, наличие в ней экссудата.

Печень, селезенку, почки стерильным пинцетом извлекают и помещают в стерильную чашку Петри для последующего микроскопического исследования. Далее вскрывается грудная полость, для чего пинцетом приподнимают грудину, рассекают диафрагму и с помощью ножниц отсекают грудину вместе с участком ребер таким образом, чтобы стали доступны легкие и сердце.

Раскаленным пинцетом прижигают стенку сердца (она при этом фиксируется с помощью другого пинцета) и кончиком пастеровской пипетки прокалывают стенку сердца. Отсасывают из сердца кровь и тут же делают посев в МПБ и на косячок МПА. Изучают состояние легких, обращают внимание на наличие экссудата в плевральной и околосердечной полостях. Для выделения чистой культуры возбудителя делается по­сев также из селезенки и печени (если нужно, то из других органов) на МПБ и МПА.

Мазки-отпечатки или препараты-оттиски готовят на одном стекле по определенной схеме:

из печени - № I;

из легких - № 2;

из селезенки - № 3;

из лимфатического узла - №.4;

на конце стекла делают один сплошной мазок из крови сердца.

Приготовить препараты-оттиски из органов мыши: печени, легких, селезенки, лимфатического узла, крови. Окрасить препарат-оттиск по способу Ионэ для обнаружения капсул. Отметить, соответствуют ли об­наруживаемые в препаратах микроорганизмы тем, которые использова­лись для заражения мыши. Составить протокол вскрытия мыши с указанием в нем обнаружен­ных изменений в органах трупа. Сделать необходимые зарисовки.

Протокол вскрытия мыши.

1. Внешний осмотр____________________________________________________

2. Состояние подкожной клетчатки______________________________________

3. Состояние лимфатических узлов______________________________________

4. Грудная полость____________________________________________________

а) легкие___________________________________________________________

б) сердце___________________________________________________________

в) медиастинальные лимфатические узлы_______________________________

5. Брюшная полость___________________________________________________

а) печень_____________________________________________________________

б) селезенка_________________________________________________________

в) почки с надпочечниками____________________________________________

6. Примечание________________________________________________________

4. а) Методика постановки опыта фагоцитоза: белой мыши внутрибрюшинно вводят 1-2 мл стериального МПБ, раздражение которым брюшины приводит к скоплению в брюшной полости большого количества лейкоцитов. Через 4-5 часов в брюшную полость мыши вводят шприцем или пастеровской пипеткой 0,5-1 мл густой взвеси суточной культуры стафилококка. Через 8-10 минут капилляром пастеровской пипетки прокалывают брюшную стенку и из брюшной полости набирают экссудат. Из экссудата готовят препараты-мазки, подсушивают, фиксируют в смеси Никифорова и окрашивают метиленовым синим. При микроскопии в мазке видны бледно-голубые лейкоциты, в их цитоплазме - синие стафилокок­ки.

б) промикроскопировать готовые препараты-мазки гонококков из гнойных выделений больного. Зарисовать картину фагоцитоза микроорга­низмов.

Препарат оттиск из органов мыши; окраска по Ионэ	Фагоцитоз гонококков Окраска ____________

5. Реакция фагоцитоза. Постановка опсоно-фагоцитарной реакции.

а) В шприц, объемом в I мл, берут 0,2 мл 3,8%-ного раствора лимоннокислого натрия и отсасывают из краевой вены уха иммунизированного кролика кровь до I мл. После осторожного перемешивания крови с цитратом натрия ее выливают в пробирку и добавляют туда 0,5мл взвеси убитых бактерий. Вновь осторожно перемешивают кровь с бактериями, и пробирку помещают в термостат на 30 минут при 370, после чего готовят препараты-мазки. Для этого хорошо обезжиривают стекло и с помощью пастеровской пипетки осторожно отсасывают слой лейкоцитов, располагающихся в виде сероватой пленки над слоем эритроци­тов.

Каплю взятой взвеси лейкоцитов наносят на стекло и готовят мазок таким же образом, как для определения формулы белой крови. Мазок высушивают на воздухе, фиксируют смесью Никифорова в течение 10 минут и окрашивают синькой Менсона в течение 30 секунд, промы­вают водой, обсушивают и рассматривают с иммерсионным объективом.

Пример вычисления фагоцитарного числа

Фагоцитарное число равно

б) Для определения опсоно-фагоцитарного числа под микроскопом ведут подсчет бактерий, поглощенных лейкоцитами. Подсчитывают общее количество бактерии, поглощенных 25 лейкоцитами. Частное от де­ления числа фагоцитированных микробов на 25 является фагоцитарным числом для испытуемой иммунной сыворотки. Таким же образом определяется фагоцитарное число нормальной (неиммунной сыворотки). Отно­шение фагоцитарного числа иммунной сыворотки к фагоцитарному числу нормальной сыворотки называется опсоническим индексом.

 

 

Фагоцитарное число в вашем исследовании равно_______________________

 

в) Методика определения завершенности фагоцитоза. 18-20-часовая агаровая культура бактерий (1 мл около I млрд. клеток) добавляется к исследуемой крови и смесь выдерживается в течение 30- 45 минут в термостате при 37 °С.

После этого готовят мазки для определения фагоцитарной актив­ности (ОФР).

Оставшуюся смесь (несколько капель) наносят на поверхность слабощелочного агара в чашке Петри, равномерно распределяют по площади 5x5 см и чашку помещают на 2 часа в термостат для подращи­вания бактерий.

Через 2 часа готовят препараты-отпечатки. Для этого вырезают из части агара, на которую наносили смесь лейкоциты-микробы, пла­стинку размером 2x4,5 см и помещают ее на предметное стекло той поверхностью, где нанесена смесь. После приготовления отпечатка с помощью пинцета пластинку сбрасывают, но так, чтобы не допустить ее скольжения по стеклу.

Препарат-мазок и препарат-отпечаток фиксируют в смеси Никифорова, окрашивают по Романовскому-Гимза в течение 25-30 минут (краску разводят перед употреблением из расчета 3 капли краски на I мл воды).

Для определения завершенности фагоцитоза в препарате-отпечатке подсчитывают 50 нейтрофилов и определяют процентное соотношение дезинтегрированных (разрушенных) и жизнеспособных клеток среди фагоцитированных микробов в лейкоците.

Погибшие бактерии при этом окрашены в розовый цвет или синий и находятся в разной стадии разрушения. Жизнеспособные клетки-более крупные и окрашены в интенсивно синий цвет.

 

6. Опыт действия лизоцима на Micrococcus lysodeikticus.

Для опыта необходимо иметь:

1.Раствор яичного белка в разведении 1:25.

2.Культуру M. lysodeikticus на косячке МПА.

3.Физиологический раствор во флаконе.

4.Пипетки емкостью в I и 5 мл.

5.Две агглютинационные пробирки.

Порядок работы

1. Пометить карандашом по стеклу опытную и контрольную пробирки.

2. В контрольную пробирку налить I мл физиологического раствора.

3. В опытную пробирку налить I мл раствора яичного белка в исходном разведении.

4. Приготовить бактериальную взвесь, для чего в пробирку с культурой M. lysodeikticus внести 5 мл физиологического раствора и, вращая пробирку между ладонями, смыть культуру.

5. В опытную и контрольную пробирки добавить по I мл полученной бактериальной взвеси и поставить пробирки в термостат на 1 час при 37 °С.

6. Через час зарегистрировать результаты опыта, отмечая полное растворение микробов+ + + +, частичное + + и отсутствие лизиса знаком «–».