Лабораторно-практические работы.

3.1. Методика определения общего белка и белковых фракций в сыворотке крови рефрактометрическим методом.

ПРИНЦИП МЕТОД А состоит в том, что степень рефракции обусловлена количеством растворенных в растворе частиц. Практически коэффициент рефракции сыворотки крови довольно точно свидетельствует о количественном содержании в ней белка.

ХОД АНАЛИЗА:

Взять 2 пробирки для центрифугирования. В одну отмерить 0,6 мл сыворотки крови, а в другую - 0,6 мл воды. Затем той же пипеткой в обе пробирки добавить по 0,6 мл насыщенного раствора сернокислого аммония. Раствор сернокислого аммония к сыворотке крови добавляют маленькими порциями, медленно, чтобы не образовались пузырьки при этом происходит осаждение глобулина. Легкими поворотами содержимое пробирки осторожно смешивают и центрифугируют пробирку с сывороткой крови 5 мин при скорости 1000 – 1500 об/мин.

Пока происходит центрифугирование сыворотки, рефрактометрируют:

1. Н₂О (дистиллированная)

2. Полунасыщенный раствор сернокислого аммония (2-ая пробирка).

3. Неосажденную сыворотку.

Записывают результаты рефрактометрирования - показатель рефракции (НД).

Рефракция солей сыворотки - величина постоянная и равна 0,002.

Из отцентрифугированной сыворотки берут каплю из прозрачного верхнего слоя и также рефрактометрируют.

 

РАСЧЕТ ДЛЯ АЛЬБУМИНОВ:

НД альбуминов = (НД осажденной сыворотки - НД полунасыщенного р-ра сернокислого аммония х 2 - 0,002/ показатель рефракции солей сыворотки).

1% р-р альбуминов имеет показатель рефракции равный 0,00177, затем рассчитывают процентное содержание альбуминов:

 

1% - 0,00177 1х НД альб.

Х% - НД альбуминов Х = 0,00177

 

РАСЧЕТ ДЛЯ ГЛОБУЛИНОВ:

НД альбуминов = (НД неосажденной сыворотки - НД воды - НД альбуминов - 0,002). 1% р-р глобулинов имеет показатель рефракции равный 0,00229. По пропорции находят содержание глобулинов:

1% - 0,00229 1х НД глоб.

Х% - НД глобулинов Х= 0,00229

По сумме альбуминов и глобулинов находят общий белок и коэффициент А/Г.

 

3.2. Методика определения белковых фракций методом электрофореза на бумаге.

ПРИНЦИП МЕТОДА: Метод основан на различии величины заряда белков сыворотки крови. Если нанести каплю сыворотки на полоску хроматографической бумаги, смоченной буферным раствором, и пропустить через эту полоску постоянный электрический ток, отдельные белки будут продвигаться в электрическом поле с различной скоростью. При рН=8,6 белки сыворотки крови движутся по направлению к аноду, поскольку они обладают в этих условиях отрицательным зарядом. Наиболее быстро движутся альбумины, затем a1- и a2-глобулины, далее b - глобулины и наконец g - глобулины.

АППАРАТУРА: Прибор для определения белков в крови методом электрофореза на бумаге состоит из выпрямителя, электрофоретической кюветы и денситометра.

ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ:

Кюветы заполняются вероналовым буфером рН = 8,6. Нарезают из хроматографической бумаги полоски длиной 38 см., шириной 3 см., полоски смачивают буферным раствором и помещают в кювету. Ближе к отрицательному полюсу наносится сыворотка (0,01 мл), затем прибор включается в электрическую сеть.

Электрофоретическое разделение белков сыворотки на бумаге производится обычно в течение 6- 24 часов при напряжении 150 Вт и силе тока 6-8 А. По истечении указанного срока бумажные полоски сушат в сушильном шкафу при температуре около 100 градусов в течение 5 мин., затем красят бромфеноловым синим. Остатки красителя, не связавшегося с белками, отмывают с полоски бумаги 10% уксусной кислотой.

Количественное определение белковых фракций проводится с помощью денситометра или путём экстрагирования спиртовым раствором щелочи с последующим определением концентрация краски фотоколориметрически.

Тема: Биохимия крови. Метаболизм гемоглобина.

Занятие №2.

Актуальность темы.

Минеральный состав крови чрезвычайно разнообразен и играет большую роль в жизнедеятельности организма, например, в процессе роста и развития ребенка обмен кальция и связанных с ним фосфатов. Снижение содержания кальция может сопровождаться повышением нервно-мышечной возбудимости, судорогами (тетания новорожденных). Развитию гипокальциемии у новорожденных способствует сахарный диабет у матери, недоношенность и т.д. Чрезмерные дозы витамина «Д» вызывают гиперкальциемию с отрицательными последствиями для организма.

Основным белком, осуществляющим снабжение тканей кислородом и освобождение их от углекислоты, является гемоглобин. В связи с этим, изучение обмена гемоглобина и определение его концентрации является чрезвычайно важным, а также актуальным является клиническое значение определения содержания желчных пигментов крови, моче и кале в дифференциальной диагностике различных видов желтух (гемолитическая, желтуха новорожденных, обтурационная, паренхиматозная).

Учебные и воспитательные цели:

Общая цель: привить знания о минеральном составе крови, механизме свертывания крови, метаболизме гемоглобина.

Частные цели:

- уметь определять уровень кальция в сыворотке крови;

- владеть методикой определения концентрации гемоглобина в крови.

 

Входной контроль знаний.

1.1. Тесты.

1.2. Устный опрос.

 

2. Основные вопросы темы:

2.1. Минеральные составные части крови, значение их для организма.

2.2. Механизм свертывания крови.

2.3. Противосвертывающая система и система фибринолиза.

2.4. Метаболизм гемоглобина. Синтез гема, гемоглобина.

2.5. Распад гемоглобина. Прямой (конъюгированный) и непрямой (неконъюгированный) билирубин.

2.6. Клиническое значение определения содержания желчных пигментов крови, моче и кале в дифференциальной диагностике различных видов желтух (гемолитическая, желтуха новорожденных, обтурационная, паренхиматозная).

 

3. Лабораторно-практические работы:

3.1. Методика определения кальция в сыворотке крови;

3.2. Методика определения концентрации гемоглобина в крови.

Выходной контроль.

4.1. Ситуационные задачи.

 

5. Литература:

5.1. Материалы лекций.

5.2. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. С. 582-585, 599-607.

5.3. Биохимия под ред. Е.С. Северина, А.Я. Николаева М.: ГЭОТАР-МЕД, 2011г.

 

2. Основные вопросы темы: