Измерение спектров люминесценции

Схема установки для измерения спектров люминесценции в видимой и ультрафиолетовой области приведена на рис. 80. Возбуждающий свет ртутно-кварцевой лампы фокусируется на объект, укрепленный в держателе, а свет люминесценции фокусируется вогнутым алюминированным зеркалом на входную щель монохроматора СФ-4. После выхода из моно-хроматора свет собирается кварцевой линзой на фотокатод фотоумножителя. Фототок измеряется с помощью какого-либо чувствительного гальванометра, например, М-91/А.

Возбуждение люминесценции. Люминесценция возбуждается светом ртутно-кварцевой лампы СВД-120 или СВДШ-250 с соответствующими светофильтрами и фокусирующими конденсорами (описание осветитель­ных устройств см. стр. 348—352).

Рис. 80. Установка для измерения спектров люминесценции. 1 — осветительное устройство, 2— лампа СВД-120 в кожухе, 3 — кварцевая колба с раствором Бекштрема (светофильтр и конденсор), 4— газовый хлор-бромный фильтр, 5 — светонепроницаемая камера для объекта, 6 — сосуд Дьюара с держателем объекта (при измерениях при комнатной температуре вместо сосуда Дьюара ставится обойма для кюветодержателя — см. рис. 84), 7 — алюминиевое вогнутое зеркало, 8 —котировочные винты для перемещения вогну­того зеркала, 9— светофильтр на входе монохроматора, 10 — монохроматор СФ-4, 11 — кварцевая линза, фокусирующая свет на фотокатод, 12 — кожух фотоумножителя, 13— фотоумножитель, 14— выход сигнала с ФЭУ, 15 — гальванометр М-91/А, 16— делитель напряжения, 17— источник высокого напряжения для питания ФЭУ

Светофильтры используются для выделения отдельных участков спектра. Основной характеристикой всякого светофильтра является величина его пропускания (Т) при различных длинах волн:

,

где I ₀ —интенсивность падающего, а I —интенсивность пропущенного светофильтром монохроматического света.

Пропускание системы из двух светофильтров (Т_ав) равно Т_а × Т _в.

При измерении люминесценции существенно отделить рассеянный объектом возбуждающий свет от света люминесценции. Важно, чтобы светофильтр, помещенный на пути возбуждающего света перед объектом, совершенно не пропускал света в области, где измеряется люминесценция, и, наоборот, пропускал как можно больше света в области поглощения объекта (рис. 86).

Рис. 86. Выбор светофильтра для возбуждения люминесценции: 1— спектр поглощения листа фасоли, 2— спектр флуоресценции листа, 3— пропускание светофильтра СЗС-8 (светофильтр хорошо пропускает в области поглощения листа, но не может быть использован, т. к. пропускает и в области флуоресценции), 4 — пропускание светофильтра СЗС-9, применяемого при люминесценции в области более 640 ммк, 5— пропускание светофильтров СЗС-8 и СЗС-9, комбинация которых позволяет измерять спектры люминесценции этиолированных и зеленых листьев, начиная от 600 мм

 

При выборе светофильтров следует исходить из спектра поглощения объекта и правила Стокса, согласно которому спектр люминесценции сдвинут в длинноволновую сторону по сравнению со спектром поглощения.

Система из двух различных светофильтров пропускает свет только тех длин волн, который пропускают оба светофильтра. Использование комбинации из нескольких фильтров часто позволяет выделять довольно узкие участки спектра. Кривые пропускания Т = f (l) нескольких стеклянных светофильтров, применяемых для измерения люминесценции, изображены на рис. 86. Стеклянные светофильтры, выпускаемые промышленностью, снабжаются паспортами, в которых приведены кривые пропускания и другие характеристики светофильтров. При работе в ультрафиолетовой области спектра приходится использовать наряду со стеклянными жидкостные и газовые светофильтры. Например, для возбуждения люминесценции белков в области 240—280 ммк используют комбинацию жидкостного светофильтра Бекштрема и газового хлорбромного фильтра от ультрафиолетового микроскопа МУФ.

Жидкостный фильтр Бекштрема представляет собой раствор сернокислого никеля
(303 г/л)и сернокислого кобальта (86,5 г/л) в дистиллированной воде. Такой раствор, разведенный в три-пять раз, наливают в кварцевую колбу, которая служит одновременно светофильтром, тепловым фильтром и конденсором (см. рис. 80 и 81, Б). Концентрацию раствора Бекштрема в колбе желательно подобрать такой, чтобы светофильтр пропускал как можно больше света в области 240—480 ммк, совершенно не пропуская света в об­ласти 282—530 ммк. Для проверки измеряют отражение света от алюминиевой пластинки, помещенной на месте объекта. Если светофильтр приготовлен правильно, то интенсивность линии 265 ммк должна быть максимальной и в то же время должна совершенно отсутствовать в отраженном свете линия 435 ммк. Для уменьшения интенсивности рассеянного возбуждающего света перед входной щелью монохроматора помещают светофильтры, пропускающие только свет в исследуемой области люминесценции и не пропу­скающие возбуждающего света. Так, например, при исследовании белков используется светофильтр БС-2, отсекающий возбуждающий свет (240—280 ммк)и пропускающий более длинноволновую люминесцен­цию. При измерении спектров люминесценции хлорофилла применяют красный светофильтр, пропускающий только люминесценцию пигмента.

Камера для объекта. Газовый светофильтр, держатель объекта и зеркало для фокусировки света люминесценции на щель монохроматора помещают в светонепроницаемой камере (например, из эбонита;» см. рис. 80). При комнатной температуре растворы измеряют в кюветах от спектрофотометра СФ-4, которые укрепляют в металлическом держателе, вставляемом в обойму (см. рис. 84, А). При низких температурах объект помещают в металлическую кювету, которую либо непосредственно погружают в сосуд Дьюара с жидким азотом, либо укрепляют в держателе, служащем холодопроводом (см. рис. 84, Б). Перемещение фокусирующего зеркала (поворот вокруг оси и приближение к щели) производят с помощью котировочных винтов.

Работа на установке. Включение установки и предварительная фокусировка возбуждающего света были описаны выше. Окончательную фокусировку лучше всего производить, используя в качестве объекта раствор хорошо люминесцирующего вещества с известным спектром люминесценции.

При работе в ультрафиолетовой области объектом может служить пустая кювета от СФ-4 со стеклянной крышкой спектрофотометра, которая при возбуждении в области 240—280 ммк люминесцирует в области около 400 ммк. Изменяя поворот зеркала и его расстояние от объекта, добиваются максимального отклонения стрелки гальванометра. Для фокусирования света на фотокатод перемещают фокусирующую линзу перед фотоумножителем, также добиваясь максимального показания прибора. Напряжение на ФЭУ подбирается согласно правилам, изложенным выше, так, чтобы величина темнового тока составляла 4—5 делений по шкале гальванометра (амплитуда шумов при этом будет не более чем 1—2 деления). Ширина щелей монохроматора должна быть по возможности наименьшей, так как это обеспечивает наилучшее разрешение структуры спектра. Как правило, ширина щели устанавливается такой, чтобы при оптимальной фокусировке стрелка гальванометра отклонялась на всю шкалу при длинах волн, соответствующих максимуму в спектре люминесценции. Желательно, чтобы при измерении в области 300—400 ммк ширина щели не превышала 0,1 мм, а в более длинноволновой области составляла несколько сотых миллиметра.

Для измерения люминесценции растворы наливают в пробирку или кювету, укрепляемую в держателе; при измерении в вакууме удобно пользоваться трубками Тунберга (см. рис. 84). Такие объекты, как листья растения, можно укрепить на держателе, изображенном на рис. 84.

Для контроля на рассеянный свет при измерениях растворов при комнатной температуре и растворов или гомогенатов при температуре жидкого азота производят измерения с растворителем. Показания прибора для каждой длины волны при измерении растворителя вычитают из показаний, полученных при измерении люминесценции раствора в той же самой кювете и в идентичных условиях.

Измерение спектра люминесценции белка при комнатной и низкой температуре

Схема установки для измерения спектров люминесценции приведена на рис. 85. Люминесценция белка возбуждается с помощью осветителя с лампой СВД-120А (см. рис. 81, Б). Область возбуждения люминесценции 240—280 ммк выделяется с помощью комбинации светофильтров: жидкостного фильтра Бекштрема и газового хлорбромного светофильтра от ультрафиолетового микроскопа МУФ. Для уменьшения рассеянного света перед входом спектрофотометра помещается светофильтр БС-2, пропускающий только свет люминесценции (более 280 ммк). На выходе моно-хроматора СФ-4 помещают фотоумножитель ФЭУ-18 в кожухе.

Включение фотоумножителя и подбор напряжения питания — см. упражнение 1 на стр. 346, включение лампы СВД-120А и фокусировку осветительного устройства — см. упражнение на стр. 350.

Приготавливают раствор белка (например, сыворо­точного альбумина человека) в концентрации 1 мг/мл. Заполняют им круглую кювету с кварцевыми крышками от спектрофотометра СФ-4. Кювету укрепляют в держателе, который помещают в обойму в камере для объекта (см. рис. 84, Л). Подбирают ширину щели, при которой отклонение стрелки гальванометра при 245 ммк будет равно 25—50 делениям. Вращают барабан длин волн и производят отсчеты по шкале гальванометра через каждые 5 ммк в интервале длин волн 285—450 ммк. Поскольку под действием возбуждающего света происходит «выцветание» белка, сопровождающееся уменьшением люминесценции, измерения нужно производить по возможности быстро, разумеется, не жертвуя.при этом точностью. Измерения спектра проводят два раза: один раз, вращая барабан длин волн в сторону больших, а другой раз — в сторону меньших длин волн,—и берут среднюю из двух измерений (I). Точно таким же образом производят контрольные измерения, поместив на место кюветы с раствором белка кювету с водой (I_К).

Затем следует рассчитать величину энергии излучения флуоресцирующего образца (в относительных единицах) при каждой длине волны:

где А — поправка на спектральную чувствительность прибора^.

На основании полученных данных строят кривую спектра люминесценции белка, откладывая по оси абсцисс длину волны, а по оси ординат — энергию излучения .

Измерения спектров люминесценции белка при температуре жидкого азота производятся на той же установке, но на место обоймы с кюветодержателем помещают сосуд Дьюара с кварцевыми окошками /см. рис. 84, Ь), в который наливают жидкий азот правила работы с жидким азотом см. стр. 380—381).

Раствор белка (1 мг/мл) наливают в металлическую кювету, предварительно охлажденную в жидком азоте. Как только раствор замерзнет, кювету опускают в сосуд Дьюара, укрепленный в установке. Угол между поверхностью образца и направлением светового пучка от осветителя должен быть почти прямым. Сохраняя этот угол постоянным, следует поворачивать сосуд Дьюара вокруг оси, наблюдая за изменениями величины фототока при 340 ммк (I). Эта величина будет максимальной при хорошей фокусировке света от образца на входную щель монохроматора. Ту же операцию следует повторить, вынув кювету из сосуда Дьюара и поставив длину волны 400 ммк. Желательно добиться того, чтобы фототок при этом был ми­нимальным, так как он обусловлен флуоресценцией стенок сосуда Дьюара (I_К). Следует установить сосуд Дьюара таким образом, чтобы отношение было наибольшим.

Измерение спектров люминесценции производится в области 285—530 ммк через каждые
5 ммк. В остальном измерение спектра и его построение производятся так же, как и в предыдущем упражнении.