Собственное свечение клеток и тканей животных

В настоящее время слабое свечение удается изучать и на целых органах в составе организма. На рисунке 9. изображен аппаратурный комплекс, применяемый для измерения собственного свечения тканей животного, например, печени или легкого.

Рис. 9. Измерение собственного свечения органов лабораторного животного (в данном случае - крысы).

Наиболее важные части комплекса - это совершенно непроницаемый для света ящик, в который помещают лабораторное животное, например крысу, и высокочувствительный приемник света - фотоумножитель, соединенный через усилитель и другие промежуточные устройства с самопишущим потенциометром или же персональным компьютером. Аналогичную конструкцию используют для изучения свечения изолированных органов, например, перфузируемого легкого или сердца. Добавляя в перфузионную жидкость ингибиторы или активаторы определенных реакций, можно судить о природе химических реакций, сопровождающихся свечением.

За собственное свечение тканей могут быть ответственны реакции:

1. Реакции активных форм кислорода и активных форм азота.

2. Реакции цепного (перекисного) окисления липидов.

 

Реакции с участием активных форм кислорода и азота

 

Активными формами кислорода (АФК) обычно называют пероксидь водорода (H₂O₂), гипохлорит (ClO^-) и кислородные радикалы: супероксид (O₂·^-) и радикал гидроксила (HO ·). Активными формами азота (АФА) являются монооксид азота (· NO), различные формы пероксинитрита (HOONO, ONOO^-, ONOOCO₂^-). Главным источником АФК и АФА в организме человека и животных служат клетки-фагоциты: гранулоциты и моноциты крови и тканевые макрофаги. Активированные фагоциты для борьбы с чужеродными клетками образуют целый букет активных форм кислорода и азота, которые, как оказалось, могут взаимодействовать друг с другом и с другими молекулами с испусканием квантов хемилюминесценции. Непосредственной причиной такого свечения считают образование синглетного кислорода (¹O₂), испускается квант света с длиной волны 1270 нм, и его возбужденного димера, испускается квант света с длинами волн 635, 580, 535 нм. Пероксинитрит взаимодействуя с остатками триптофана и тирозина белков, переводит их в электронно-возбужденное состояние. При переходе молекул в основное состояние испускается квант света в видимой области.

 

Свечение при реакциях цепного окисления липидов

Одна из главных составляющих собственной (неактивированной) хемилюминесценции животных клеток и тканей - свечение, сопровождающее цепное окисление липидов в мембранных структурах клеток и липопротеинах крови. Эта реакция идет с участием свободных радикалов липидов L ·и липопероксидов LOO ·, которые как бы "ведут" цепи окисления В реакции взаимодействия двух радикалов липопероксида (LOO ·) образуются молекулы кетона и кислорода в электронно-возбужденном состоянии, которые затем переходят в основное состояние, испуская квант света. Чем больше радикалов LOO · в системе, то есть чем энергичнее идут цепные реакции окисления липидов, тем выше интенсивность хемилюминесценции, сопровождающей реакцию радикалов. Вещества, реагирующие со свободными радикалами и тем самым тормозящие цепное окисление липидов (так называемые антиоксиданты), одновременно подавляют хемилюминесценцию. Изучая влияние различных природных и синтетических соединений на характеристики хемилюминесценции, можно судить о способности этих веществ защищать наш организм от вредного действия свободных радикалов и тем самым отбирать кандидатов на определенные лекарства.

 

Активированная хемилюминесценция

Собственная хемилюминесценция, сопровождающая биохимические реакции в клетках и тканях, обладает, как правило, очень низкой интенсивностью.

Существует несколько причин низкого квантового выхода хемилюминесценции.

1. Концентрация радикалов в биологических системах очень мала из-за их высокой химической активности, поэтому малы и скорости реакций, сопровождающихся свечением.

2. Не любое химическое взаимодействие радикалов приводит к образованию электронно-возбужденных молекул продуктов реакции. В подавляющем большинстве окислительно-восстановительных взаимодействий между молекулами или радикалами электрон переносится не на уровень возбужденного состояния, а на самый нижний свободный уровень, и последующего высвечивания кванта не происходит.

3. Даже если и образовалась возбужденная молекула продукта, вероятность того, что высветится квант, а не произойдет растраты энергии в тепло, тоже обычно очень мала.

Две последние причины приводят к тому, что квантовый выход хемилюминесценции в случае, скажем, реакции двух перекисных радикалов составляет всего 10^-8-10^-10.

Квантовый выход образования возбужденных молекул продукта:

 

а квантовый выход люминесценции продукта:

 

 

для кетонов.

Таким образом, общий квантовый выход хемилюминесценции равен 10^-8-10^-10.

Для усиления свечения надо увеличить Q_ХЛ или Q_ВОЗБ или Q_ЛЮМ или и то и другое. Соединения, которые реагируют с радикалами с образованием возбужденных молекул продуктов, такие как люминол или люцигенин, называют химическими активаторами хемилюминесценции, или хемилюминогенными зондами. Они увеличивают Q_ВОЗБ. Существуют и такие вещества, которые перехватывают возбужденные состояния продуктов и высвечивают кванты с высоким выходом (т. е. увеличивают Q_ЛЮМ). Их называют физическими активаторамихемилюминесценции.

Химические активаторы ХЛ - это соединения, вступающие в реакции с активными формами кислорода или органическими свободными радикалами, в ходе которых образуются молекулы продуктов в возбужденном электронном состоянии.

Активатор + радикалы ® продукт* ® продукт + фотон

Известными активаторами хемилюминесценции являются люминол и люцигенин.

Физические активаторы не вступают в химические реакции и не влияют на ход реакций, сопровождающихся свечением, но тем не менее многократно усиливают интенсивность хемилюминесценции. В основе их действия лежит физический процесс процесса переноса (миграции) энергии с молекулы продукта хемилюминесцентной реакции на активатор:

Радикалы ® продукт* ® продукт + фотон 1 (неактивированная ХЛ)

Продукт* + активатор ® продукт + активатор* ® фотон 2 (активированная ХЛ)

К физическим активаторам можно отнести некоторые красители и комплексы редкоземельных элементов.

Примеры.

У больных инфарктом миокарда в моче могут появиться очень небольшие количества миоглобина. Гем-содержащие соединения, к которым относится миоглобин, дают очень яркое свечение в присутствии перекиси водорода и люминола в сильно щелочной среде. Свечение мочи в этих условиях может служить одним из показателей инфаркта у больного.

На поверхности свежей раны выделяется жидкость, называемая раневым экссудатом. В ней содержится каталаза - фермент, разлагающий перекись водорода без образования свободных радикалов. Наряду с этим жидкость содержит другие гем-содержащие белки и ионы железа, которые катализируют разложение перекиси водорода с образованием свободных радикалов кислорода, токсичных для клеток окружающей ткани. При добавлении к раневому экссудату перекиси водорода с люминолом наблюдается хемилюминесценция, тем более сильная, чем больше радикалов образуется при разложении перекиси. Таким образом, хемилюминесценция показывает, сколько токсичных радикалов образуется в экссудате. В свежей ране таких радикалов много, а по мере заживления их становится все меньше и меньшее. Ускорение заживления ран за счет применения лекарственных средств или облучения светом лазера сопровождается соответственным снижением хемилюминесценции экссудата. Таким образом, этот метод позволяет врачу контролировать эффективность лечения и вносить коррективы в сроки и дозы применения лечебных процедур.

 

Биолюминесценция

 

Биолюминесценция - это свечение живых организмов, видимое простым глазом. Способностью к биолюминесценции обладают организмы, принадлежащие к самым разным систематическим группам: бактериям, грибам, моллюскам, насекомым. Механизм реакций, сопровождающихся свечением, весьма различен у разных видов; однако обычно включает в себя химическое превращение определенного низкомолекулярного субстрата, называемого люциферином, катализируемое ферментом, называемым люциферазой.

Измерение биолюминесценции бактерий можно использовать для определения низких концентраций кислорода. Дело в том, что в отсутствие кислорода фотобактерии не характеризуются свечением, свечение усиливается пропорционально концентрации кислорода в среде в интервале концентраций О₂ от 2•10^-8 до 5•10^-6 моль/л. Можно использовать светящиеся бактерии и в качестве "лабораторного животного", т. е. живых организмов, на которых изучают, к примеру, действие различных токсических веществ. Светящиеся бактерии весьма чувствительны к примесям токсических веществ в воде, и измерение биолюминесценции можно использовать для оценки загрязнения воды токсическими соединениями, скажем ионами тяжелых металлов. Свечение бактерий можно использовать для предварительной оценки эффективности новых антибиотиков.