Молекулярно-генетические методы: рестрикция и электрофорез ДНК.

• В основе лежат современные методики работы с ДНК или РНК.

• - позволяют анализировать фрагменты ДНК, находить и изолировать отдельные гены и их сегменты и устанавливать в них последовательность нуклеотидов.

• Начальным этапом любого молекулярно-генетического анализа является получение образцов ДНК или РНК. Для этого используют геномную ДНК (вся ДНК клетки) или отдельные ее фрагменты.

• чтобы получить достаточное количество таких фрагментов, необходимо, амплифицировать (размножить) их.

Рестрикция ДНК

• Анализировать огромные молекулы ДНК в том виде, в котором они существуют в клетке, невозможно. Поэтому их необходимо разделить на части, обработать разными рестриктазами — бактериальными эндонуклеазами.

• Эти ферменты способны разрезать двойную спираль ДНК, причем места разрыва строго специфичны для данного образца.

Электрофорез ДНК

• Фракционирование (т.е. разделение) фрагментов ДНК по размеру и длине проводится с помощью электрофореза на поверхности агарозного или полиакриламидного геля.

• Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигрировать через гель. Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицательно и поэтому цепи ДНК двигаются от катода, заряженного отрицательно, к положительному аноду. Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее.

• После разделения (иногда краситель вносят в расплавленную агарозу) фрагменты ДНК разной длины визуализируют при помощи флюоресцентных красителей, специфично взаимодействующих с ДНК, например, агарозные гели обычно красят бромистым этидием, который интеркалирует между азотистыми основаниями дуплекса и флюоресцирует в УФ-лучах.

Визуализация гелей с результатами электрофореза ДНК

• Для ДНК электрофореза обычно используют агарозные (для относительно длинных молекул ДНК) и полиакриламидные (для высокого разрешения коротких молекул ДНК, например, в случае секвенирования) гели.

• Фотография агарозного геля после ДНК-электрофореза.

• Результат электрофоретического разделения продуктов ПЦР-реакции. Агарозный гель окрашен бромистым этидием. Визуализация посредством облучения ультрафиолетом с длинной волны 312нм

 

Молекулярно-генетические методы: блот-гибридизация.

• В основе лежат современные методики работы с ДНК или РНК.

• - позволяют анализировать фрагменты ДНК, находить и изолировать отдельные гены и их сегменты и устанавливать в них последовательность нуклеотидов.

• Начальным этапом любого молекулярно-генетического анализа является получение образцов ДНК или РНК. Для этого используют геномную ДНК (вся ДНК клетки) или отдельные ее фрагменты.

• чтобы получить достаточное количество таких фрагментов, необходимо, амплифицировать (размножить) их.

Блот-гибридизация

• Для выявления специфических фрагментов ДНК используется метод блот-гибридизации по Саузерну. Эта методика состоит из следующих этапов:

• после окончания электрофореза гели помещают в щелочной раствор для денатурации фрагментов ДНК - получают одноцепочечные ДНК;

• одноцепочечные ДНК вымывают из геля на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтры перпендикулярным поверхности геля током буфера; одноцепочечные фрагменты ДНК фиксируют на фильтре;

 

• для визуального выявления нужных фрагментов проводят гибридизацию исследуемого образца со специфическим по нуклеотидной последовательности меченным радиоактивно или флюоресцентной меткой олигонуклеотидным синтетическим зондом;

• радиоактивно меченные участки выявляют путем экспонирования фильтра с рентгеновской пленкой (ауторадиография);

• флюоресцентные метки выявляют в люминесцентном микроскопе.

• Этот метод позволяет обнаружить единственный ген среди десятков тысяч.

• С помощью метода Саузерна можно составить рестрикционную карту генома в участке исследуемого гена и установить, несет ли данный ген какие-либо дефекты.

 

Молекулярно-генетические методы: секвенирование ДНК.

• В основе лежат современные методики работы с ДНК или РНК.

• - позволяют анализировать фрагменты ДНК, находить и изолировать отдельные гены и их сегменты и устанавливать в них последовательность нуклеотидов.

• Начальным этапом любого молекулярно-генетического анализа является получение образцов ДНК или РНК. Для этого используют геномную ДНК (вся ДНК клетки) или отдельные ее фрагменты.

• чтобы получить достаточное количество таких фрагментов, необходимо, амплифицировать (размножить) их.

Секвенирование ДНК

• определение первичной нуклеотидной последовательности (от англ. sequence — последовательность).

• В результате секвенирования получается линейное символьное описание, которое сжато резюмирует атомную структуру молекулы ДНК.

• Для секвенирования применяются методы Эдмана, Сэнжера и другие;

• в настоящее время для секвенирования нуклеиновых кислот обычно применяется метод Сэнжера с дидезоксинуклеозидтрифосфатами (ddNTP).

• Обычно до начала секвенирования при помощи ПЦР производят амплификацию участка ДНК, последовательность которого требуется определить.

• Методология секвенирования была разработана в конце 1970-х гг. английским биохимиком Фредериком Сэнжером.

Секвенирование ДНК по Сэнжеру

• Перед секвенированием молекулу ДНК разрезают на фрагменты и клонируют в Escherichia coli. Выделенные из бактериальных клеток фрагменты многократно амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)

• Раствор с одноцепочечными фрагментами и праймерами распределяют по четырём пробиркам, в каждую из которых добавлены четыре разные dNTP и один из флуоресцентно меченных дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ddNTP). Удлинение гибридизовавшегося с ДНК-фрагментом праймера происходит до тех пор, пока в цепь не включится ddNTP. В этом месте синтез останавливается, и в результате в каждой из пробирок образуется уникальный набор отрицательно заряженных фрагментов разной длины, оканчивающихся одним из меченых ddNTP.

• Фрагменты разделяют по размеру с помощью капиллярного электрофореза. Когда фрагменты определённой длины проходят через окно детектора, освещаемое лазерным лучом, ddNTP начинают флуоресцировать. Длина волны флуоресценции зависит от того, какой именно ddNTP находится у них на конце, так что на выходе получается цветная картинка, которую можно трансформировать в нуклеотидную последовательность.

Автоматическое секвенирование ДНК

• Особенно перспективным для массового секвенирования в автоматическом режиме оказалось применение меченых различными флуорохромами дидезоксинуклеотидов. В этом варианте секвенирования каждому из нуклеотидов соответствует свой цвет полосы в геле, что хорошо распознается в автоматическом режиме.

• Этот метод нашел широкое применение в реализации программы «Геном человека».

Технология пиросеквенирования

• Во время работы автоматического секвенатора нуклеотиды проходят последовательно, в определенном порядке, через миллион микроскопических лунок специального планшета, где находятся частицы с иммобилизованными на них копиями одноцепочечных фрагментов ДНК из библиотеки фрагментов образца ДНК.

• При прохождении нуклеотидов происходит одновременное секвенирование уникальных одноцепочечных ДНК на каждой частице, в каждой лунке планшета.

• Если через лунку проходит нуклеотид, комплементарный матрице, полимераза удлиняет цепь, встраивая этот нуклеотид.

• Добавление нуклеотида приводит к высвобождению пирофосфата и далее к реакции, генерирующей световой сигнал.

• Этот сигнал регистрируется CCD-камерой прибора.

• Интенсивность сигнала пропорциональна количеству нуклеотидов, встроенных в цепь ДНК за время одного прохода нуклеотидов.