Наиболее широко применяемые адъюванты

Адъювантами могут быть неорганические (фосфаты алюминия и кальция, хлористый кальций и др.) и органические (агар, глицерол, протамины и др.) вещества. В настоящее время наиболее широко применяются следующие адъюванты

• Неполный адъювант Фрейнда

Представляет собой водно-жировую эмульсию, содержащую вазелиновое масло, ланолин и эмульгатор. Депонирует антиген и усиливает его захват фагоцитами.

• Полный адъювант Фрейнда

Включает в себя, кроме вышеперечисленных компонентов, БЦЖ или мурамилдипептид. Это позволяет ему дополнительно активировать макрофаги и костимулировать Т-клетки.

• Алюминиевые квасцы

Гидроксид алюминия, A l (O H) 3 {\displaystyle ~\mathrm {Al(OH)_{3}} }, который благодаря высокой способности к сорбции выполняет функцию антигенного депо, а также неспецифически усиливает фагоцитоз.

• Bordetella pertussis с квасцами

Изготовлен из ослабленного штамма B. pertussis, сорбированного на A l (O H) 3 {\displaystyle ~\mathrm {Al(OH)_{3}} }. Действие гидроксида алюминия дополняется активацией макрофагов и костимуляцией Т-клеток.

• Иммуностимуляторный комплекс (ISCOM)

Представляет собой липидные мицеллы, окружающие белковые (чаще всего вирусные) частицы. Частицы антигена доставляются непосредственно в цитозоль Т-клеток, чем достигается индукция Т-киллеров.

Адъюванты нового поколения

В отличие от квасцов, которые издавна используют для повышения эффективности вакцинирования, адъювант Фрейнда не может применяться с аналогичной целью из-за многочисленных побочных эффектов. Это побудило к поискам безвредных адъювантов. Среди них высокой эффективностью отличаются некоторые полиэлектролиты, такие как, полиоксидоний.

Применение адъювантов

• в медицине - при изготовлении вакцин;
• в лабораторной практике - для усиления выработки антител при иммунизации животных, в процессе получения гибридом.

Иммуномодуляторы — природные или синтетические вещества, способные оказывать регулирующее действие на иммунную систему. По характеру их влияния на иммунную систему их подразделяют на иммуностимулирующие и иммуносупрессивные.

Иммуностимуляторы

К иммуностимуляторам относятся препараты тимуса, интерлейкины, интерфероны, биологически активные пептиды, полисахариды некоторых грибов, лечебные вакцины. Их активность обусловлена способностью воздействовать на метаболизм клеток и тканей организма, активировать иммунокомпетентные клетки.

Иммуносупрессоры

Иммуносупрессоры используются для подавления активности лимфоидных клеток при воспалении, аллергии, трансплантации, лечении аутоиммунных заболеваний.

Основные группы иммуносупрессоров — это гормональные препараты, цитостатические средства, антилимфоцитарные и анти-резус иммуноглобулины, моноклональные антитела против определенных рецепторов лимфоцитов, некоторые антибиотики (циклоспорин, рапамицин и др.). Их иммуносупрессорная активность связана со способностью угнетать гемопоэз, взаимодействовать с белками, участвующими в иммунном ответе, ингибировать синтез нуклеотидов, индуцировать апоптоз лимфоцитов и др.

Как и иммуностимуляторы, их получают из тканей животных и растений, путём биосинтеза с применением методов генетической инженерии и химического синтеза.

ВОПРОС

Моноклональные антитела — антитела, вырабатываемые иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону, то есть произошедшими из одной плазматической клетки-предшественницы. Моноклональные антитела могут быть выработаны против почти любого природного антигена (в основном белки и полисахариды), который антитело будет специфически связывать. Они могут быть далее использованы для детекции (обнаружения) этого вещества или его очистки. Моноклональные антитела широко используются в биохимии, молекулярной биологии и медицине.

КЛИНИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА РАСТВОРИМЫХ АНТИГЕНОВ.

Почти все известные схемы анализа растворимых антигенов на основе монАТ можно отнести к двум типам: метод «двойного сэндвича» (рис.1.) и конкурентный анализ (рис.2.). В обоих случаях используют твердофазный носитель, на который прикрепляют (сорбируют) тем или иным способом монАТ. Далее, в случае «двойного сэндвича», этот носитель инкубируют с исследуемым раствором (чаще всего это биологические жидкости, которые хотят проверить на содержание в них какого-либо белка или низкомолекулярного соединения). Во время инкубации этот антиген (если он имеется в исследуемом растворе) связывается с монАТ, все несвязавшиеся компоненты образца удаляют, промывая твердый носитель буферными растворами или водой. Затем инкубируют со «вторыми» моноклональными антителами, которые, во-первых, должны быть направлены к другой части молекулы антигена, не экранированной первыми сорбированными монАТ, а, во-вторых, должны иметь на себе какую-либо метку, позволяющую регистрировать наличие или отсутствие присоединения «вторых» монАТ к твердому носителю и делать выводы о наличии и количественном содержании искомого антигена в растворе.

Недостатком этого метода является необходимость иметь два монАТ, направленных к разным участкам молекулы антигена и не мешающих друг другу связываться с антигеном. Существует ряд антигенов, как правило, низкомолекулярных, для которых невозможно получить такую пару монАТ по той причине, что антиген имеет только одну антигенную детерминанту, либо антигенные детерминанты расположены на недостаточном расстоянии друг от друга для того, чтобы две достаточно крупные молекулы антител могли независимо их связывать.

В таких случаях используют в среднем менее чувствительный конкурентный анализ. Для этого на твердофазный носитель прикрепляют монАТ, затем инкубируют его с исследуемым образцом, куда предварительно добавили меченый антиген, который хотят обнаружить в образце. При наличии в образце искомого антигена (естественно, немеченого) последний препятствует связыванию меченого антигена с сорбированными монАТ (конкурирует с ним за связывание с монАТ). В результате самый сильный сигнал наблюдают при отсутствии в исследуемом растворе искомого антигена (отрицательный контроль), а о содержании антигена можно судить по уровню снижения сигнала по сравнению с отрицательным контролем.

ДИГНОСТИКА ВИРУСОВ, БАКТЕРИЙ И ПАРАЗИТОВ

Для диагностики вирусов, бактерий и паразитов чаще применяют вышеописанный метод «двойного сэндвича». Все эти антигены относятся к крупным надмолекулярным образованиям, поэтому стерических проблем со связыванием антител не бывает, даже если и «первые», сорбированные, и «вторые» меченые монАТ направлены к одной и той же антигенной дереминанте, так как каждая антигенная детерминанта многократно повторена на целой клетке или вирусной частице.

ВОПРОС

Живые вакцины

 

Они содержат ослабленный живой микроорганизм. Примером могут служить

вакцины против полиомиелита, кори, паротита, краснухи или туберкулеза.

Могут быть получены путем селекции (БЦЖ, гриппозная). Они способны

размножаться в организме и вызывать вакцинальный процесс, формируя

невосприимчивость. Утрата вирулентности у таких штаммов закреплена

генетически, однако у лиц с иммунодефицитами могут возникнуть серьезные

проблемы. Как правило, живые вакцины являются корпускулярными.

 

Живые вакцины получают путем искусственного аттенуирования

(ослабления штамма (BCG - 200-300 пассажей на желчном бульоне, ЖВС - пассаж

на ткани почек зеленых мартышек) либо отбирая естественные авирулентные

штаммы. В настоящее время возможен путь создания живых вакцин путем генной

инженерии на уровне хромосом с использованием рестриктаз. Полученные штаммы

будут обладать свойствами обеих возбудителей, хромосомы которых были взяты

для синтеза. Анализируя свойства живых вакцин следует выделить, как

положительные так и их отрицательные качества.

 

Положительные стороны: по механизму действия на организм напоминают

"дикий" штамм, может приживляться в организме и длительно сохранять

иммунитет (для коревой вакцины вакцинация в 12 мес. и ревакцинация в 6

лет), вытесняя "дикий" штамм. Используются небольшие дозы для вакцинации

(обычно однократная) и поэтому вакцинацию легко проводить организационно.

Последнее позволяет рекомендовать данный тип вакцин для дальнейшего

использования.

 

Отрицательные стороны: живая вакцина корпускулярная - содержит 99%

балласта и поэтому обычно достаточно реактогенная, кроме того, она способна

вызывать мутации клеток организма (хромосомные аберрации), что особенно

опасно в отношении половых клеток. Живые вакцины содержат вирусы-

загрязнители (контаминанты), особенно это опасно в отношении обезьяннего

СПИДа и онковирусов. К сожалению, живые вакцины трудно дозируются и

поддаются биоконтролю, легко чувствительны к действию высоких температур и

требуют неукоснительного соблюдения холодовой цепи.

 

Хотя живые вакцины требуют специальных условий хранения, они

продуцируют достаточно эффективный клеточный и гуморальный иммунитет и

обычно требуют лишь одно бустерное введение. Большинство живых вакцин

вводится парентерально (за исключением полиомиелитной вакцины).

 

На фоне преимуществ живых вакцин имеется и одно предостережение, а

именно: возможность реверсии вирулентных форм, что может стать причиной

заболевания вакцинируемого. По этой причине живые вакцины должны быть

тщательно протестированы. Пациенты с иммунодефицитами (получающие

иммуносупрессивную терапию, при СПИДе и опухолях) не должны получать такие вакцины.

ВОПРОС

В классическом варианте такие вакцины состоят из плазмидных ДНК, содержащих гены возбудителей инфекционных заболеваний (целевые гены, или иммуногены). Продукты данных генов способны вызывать развитие защитных реакций организма, выступая в этом случае в роли антигенов. Доставку ДНК в макроорганизм первоначально осуществляли в комплексе с катионными липидами, однако эффект от введения препарата чистой нуклеиновой кислоты оказался более выраженным. Введенная в организм ДНК проникает в клеточное ядро, превращая клетку в завод по производству вакцины. Такая ДНК длительное время существует вне хромосом без репликации, транскрибируется за счет ферментов хозяйской клетки и экспрессирует соответствующие гены, продукты которых вызывают формирование иммунитета

Ем же ДНК-вакцины хороши?

• индуцируют гуморальный (образование антител) и клеточный (активация цитотоксических Т-лимфоцитов) иммунные ответы;
• активируют систему интерферонов;
• могут избирательно воздействовать на различные субпопуляции лимфоцитов. Принципиально возможна разработка ДНК-вакцин, которые избирательно активируют разные типы Т-хелперных лимфоцитов. Благодаря этому могут быть созданы генные вакцины для лечения лиц с аутоиммунными или аллергическими заболеваниями, патогенез которых связан с нарушением различных звеньев иммунной регуляции;
• способствуют формированию длительного иммунитета;
• отсутствует присущий живым вакцинам риск реверсии вирулентности;
• могут производить одновременно несколько антигенов;
• обладают широкими возможностями модификации (сайт-специфический мутагенез, включение различных регуляторных последовательностей);
• отличаются высокой стабильностью. Они способны выдерживать низкие и высокие температуры (немногим ниже температуры кипения воды) и разные условия влажности. Поэтому ДНК-вакцины не требуют организации «холодовых цепочек» (комплекса мероприятий, обеспечивающих хранение вакцин в холодильных установках на всем пути от места производства до конечного потребителя). Таким образом, стоимость транспортировки и хранения ДНК-вакцин значительно ниже.

Но... всё хорошее имеет свои недостатки

• более низкая по сравнению с живыми вакцинами эффективность, особенно по отношению к крупным млекопитающим и человеку, и потому необходимость многократной иммунизации;
• отсутствие эффективной доставки в антигенпрезентирующие клетки;
• формирование иммунитета только в отношении протеиновых компонентов болезнетворных микроорганизмов, поскольку целевые гены кодируют белки. ДНК-вакцины не могут заменить препараты, действие которых основано на использовании антигенных молекул другой природы, например капсульных антигенов, представленных полисахаридами (полисахаридные пневмококковые, менингококковые, брюшнотифозные вакцины и др.);
• вероятность атипического процессинга и биохимических изменений (например, гликозилирования) антигенов в эукариотических клетках;
• возможность ослабления иммунного ответа на целевой антиген из-за иммуногенности вирусных компонентов (при использовании вирусных систем доставки);
• отсутствие данных о безопасности таких вакцин, т.к. не изучены последствия, к которым приводит длительная экспрессия в макроорганизме чужеродной генетической информации;
• возможность развития нежелательных иммунологических реакций в виде хронических воспалительных процессов или генерализованной иммуносупрессии из-за пролонгированной экспрессии антигена в макроорганизме.

ВОПРОС

Можно выделить три основные группы препаратов, подавляющих начальные (адсорбция, проникновение и депротеинизация), средние (синтез компонентов) и заключительные [композиция (сборка) и высвобождение] стадии взаимодействия вирусов с клетками.

Ингибиторы адсорбции, проникновения и депротеинизации. Обнаружен ряд синтетических препаратов, ингибирующие ранние этапы репродукции вирусов. Наиболее активными из них оказались «СИМО» — аналог сиаловой кислоты и «AMps» — α-аминопараметоксифенилметансульфоновая кислота, препятствующая адсорбции вирионов вируса гриппа типа А на клетках.

Ремантадин и амантадин специфически блокируют стадию раздевания вируса и вызывают накопление промежуточных продуктов раздевания. Они блокируют слияние вирусной оболочки с лизосомальной мембраной, блокируется удаление белка М, и вирусный геном не выходит из лизосомы. Оба препарата ингибируют репродукцию ряда вирусов — гриппа, болезни Ньюкасла, кори, краснухи, везикулярного стоматита, альфа-вирусов и других липидсодержащих вирусов. Амантадин и ремантадин — эффективные средства химиотерапии и химиопрофилактики гриппа.

Ингибиторы синтеза вирусных компонентов. Это главным образом аномальные нуклеозиды, которые ингибируют функции вирусных полимераз, а при включении во вновь синтезируемые нуклеиновые кислоты делают их нефункциональными. Наиболее известные препараты этой группы — азидотимидин, ацикловир, рибавирин.

Азидотимидин (зидовудин) ингибирует обратную транскриптазу, избирательно взаимодействует с ферментом ретровирусов, включая ВИЧ.

Ацикловир — нуклеозидный аналог гуанозина с высокой избирательностью к инфицированным вирусами клеткам. В клетках после последовательных превращений ацикловира образуется ациклогуанозинтрифосфат, который ингибирует ДНК-полимеразу вирусов, тормозя образование полноценной молекулы нуклеиновой кислоты, так как из-за отсутствия гидроксильной группы к ациклогуанозинтрифосфату не могут присоединиться последующие нуклеотиды. Препарат не влияет на синтез ДНК в незаряженной клетке, так как в них он не превращается в активную форму. Он эффективен при лечении инфекций, вызванных вирусом простого герпеса.

Рибавирин — имеет широкий спектр действия, обладая эффективностью против ДНК — и PHK-содержащих вирусов — вирусов гриппа, парагриппа, полиомиелита, риновируса, везикулярного стоматита, герпеса, осповакцины и др.

Ингибиторы сборки и освобождения потомства вирионов. Такими ингибиторами являются производные тиосемикарбазонов. Практическое применение нашел метисазон. Антивирусное действие его обусловлено подавлением трансляции поздних вирусных иРНК и сборки вирусных частиц. Препарат активен против вирусов оспы.

Ингибиторы протеаз. Известно, что для возникновения инфекционного процесса необходима протеолитическая активность вируса, т. е. нарезание одного или нескольких его белков. Сущность этого феномена заключается в том, что многие вирусные белки приобретают функциональную активность лишь после протеолитического нарезания. У пикорна-, тога-, ретро — и других вирусов этот процесс лежит в основе формирования всех структурных вирусных белков, которые образуются в результате нарезания белка — предшественника. У ортомиксо-, парамиксо-, рео-, бунья-, арена — вирусов и других протеолитическому нарезанию подвергаются в первую очередь гликопротеиды. Так, например, у парамиксовирусов на суперкапсидной оболочке вириона два гликопротеида: HN (гемагглютинин/нейраминидаза) и F (белок слияния); у вирусов гриппа НА (гемагглютинин) и NA (нейраминидаза). В процессе инфекции вирусные гликопротеиды у вирусов обоих семейств претерпевают протеолитическое нарезание. У парамиксовируеов белок F₀ нарезается на два гликопротеида — F₁ и F₂; у ортомиксовирусов протеолизу подвергается гемагглютинин, который нарезается на два фрагмента — НА1 и НА2.

Вирионы приобретают способность заражать клетки (т. е. становятся инфекционными) лишь после нарезания (НА → НА1 + НА2, F₀ → F₁ + F₂). Чем выше уровень протеолитического нарезания вируса в организме, тем интенсивнее развитие инфекционного процесса и выше вирулентность вируса.

Нарезание белков у различных вирусов осуществляется либо только клеточными, либо клеточными и вирусспецифическими протеазами. Для правильного нарезания белка, обеспечивающего его активность, необходимы протеазы определенной специфичности. Отсюда следует, что подавление активности протеаз, участвующих в нарезании вирусных белков, должно блокировать способность вирионов заражать чувствительные клетки.

В последние годы проводятся многочисленные эксперименты на модели ВИЧ. Отмечают усиление противовирусной эффективности при совместном использовании ингибиторов протеаз ВИЧ и аномальных нуклеозидов.

Ингибиторами протеаз являются препараты: гордокс, контрикал, апротинин и др.

ВОПРОС

Инактиви́рованная вакци́на (или уби́тая вакци́на) состоит из вирусных частиц, которые выращены в культуре, а затем были убиты при помощи метода термической обработки либо воздействием клеточного яда (формальдегида). Данные вирусы выращиваются в контролируемых лабораторных условиях для снижения антигенности и являются неинфекционными (не способными вызвать заболевание). Для выработки иммунитета необходимо введение больших доз, применение адъювантов и многократных туров вакцинопрофилактики. Инактивированные вакцины дифференцируют с аттенуированными или «живыми» ослабленными вакцинами.