Преимущества перед живыми вакцинами

• не вызывают вакциноассоциированных заболеваний;
• индуцируют гуморальный и, возможно, клеточный иммунитет;
• иммунитет менее напряжённый, чем вызываемый живыми вакцинами.

Потенциальные проблемы

• недостаточная инактивация вируса;
• разрушение вакцины при замораживании;
• необходимо проведение бустерной вакцинации;
• наличие в составе адъювантов (например, гидроксид алюминия) и стабилизаторов (желатин, сорбитол);
• повышен риск развития аллергических реакций.

ВОПРОС

Субъединичные вирусные вакцины обычно являются набором протективных вирионных белков или отдельным поверхностным протективным белком.

Для создания субъединичных вакцин используют три метода.

Первый метод — получение большого количества вирусов, очистка и выделение иммуногенных субъединиц; это так называемые сплит-вакцины. Однако этот способ является дорогостоящим, и он вряд ли найдет когда-либо промышленное применение.

Второй метод — химический синтез специфического иммуногена. При его использовании необходимо знание структуры и аминокислотного состава антигенных детерминант. Детерминантные участки, которые включают в себя только несколько аминокислот, могут быть синтезированы химически и соединены с белком-носителем, таким, как бычий сывороточный альбумин; затем сцепленный белок используют в качестве вакцины. К сожалению, это требует технологически сложного пептидного синтеза.

Третий метод — рекомбинантный.

Субъединичные вакцины имеют и достоинства, и недостатки. Достоинства состоят в том, что препарат, в состав которого входит очищенный иммуногенный вирусный белок, безопасен, стабилен, не содержит дополнительных балластных белков и нуклеиновых кислот, которые могли бы вызвать нежелательные побочные эффекты при вакцинации. Недостатки заключаются в том, что очистка полученного белка стоит дорого, а конформация полипептида может отличаться от той, которую он имеет в составе вирусного капсида, что может приводить к изменению его антигенных свойств. Несмотря на это, направление исследований по разработке субъединичных противовирусных вакцин — одно из наиболее перспективных в вакцинологии.

ВОПРОС

Ингибиторы, способные нейтрализовать активность вирусов, содержатся в плазме крови, секретах, тканях животных и человека; они действуют как на ДНК, так и на РНК-содержащие вирусы. Наряду с качественными и количественными различиями в содержании сывороточных ингибиторов у различных видов животных существуют индивидуальные, а также колебания в количестве ингибиторов у одного и того же животного в разные периоды жизни. Ингибиторы делятся на:

1) термолабильные (рингибиторы), разрушающиеся при температуре 62—65 °С в течение часа,
2) термостабильные: умеренно термостабильные (аингибиторы), разрушающиеся при температуре 75 °С, и высокотермостабильные (уингибиторы), выдерживающие нагревание до 100 °С.

Термолабильные рингибиторы, являющиеся липопротеинами, обычно очень активны и способны нейтрализовать инфекционную активность ряда вирусов: гриппа (типов А и В), парагриппозных, аденовирусов, энтеровирусов, вируса кори и др.
Умеренно термостабильные «ингибиторы (ингибитор Френсиса) являются мукопротеинами. Высокотермостабильный уингибитор обнаружен в сыворотке крови многих животных и человека. Активность его очень велика: он способен нейтрализовать сотни и тысячи инфекционных доз вируса гриппа. По химическому составу ингибитор является нерастворимым эйглобулином, соединенным с белком. Количество ингибиторов в организме животных при заболевании или иммунизации изменяется.

Механизм действия вирусных ингибиторов и антител сходен. При взаимодействии с вирусами ингибиторы оседают на поверхности вириона, блокируя его, в результате чего вирус теряет способность адсорбироваться чувствительной клеткой, не может в нее проникнуть и репродуцироваться. Поскольку ингибиторы обладают довольно широким спектром активности в отношении различных вирусов, их можно считать факторами неспецифического иммунитета. Однако некоторая специфичность действия ингибиторов все же имеется. Она связана с общими химическими группами у вирусных частиц, которые и взаимодействуют с ингибиторами. Так, ингибиторы, относящиеся к категории мукополисахаридов и имеющие в составе нейраминовую кислоту, нейтрализуют миксовирусы, а ингибиторы, относящиеся к категории липопротеинов, подавляют активность вирусов полиомиелита, клещевого энцефалита и др.

Фагоцитарная реакция в защите от вирусной инфекции не играет такой роли, как при защите макроорганизма от бактериальных инфекций. Неспособность фагоцитов справиться с вирусами объясняется прежде всего биологическими особенностями последних. Вирусы — внутриклеточные паразиты; клетка является естественной средой их обитания. Вирионы легко захватываются лейкоцитами, но дальнейшее их разрушение там не происходит, т. е. наблюдается явление незавершенного фагоцитоза. Незавершенный фагоцитоз наблюдается и при некоторых бактериальных инфекциях, например при гонорее, туберкулезе. Но при бактериальных инфекциях это явление рассматривается как исключение. Значение фагоцитоза в захватывании и разрушении вирусов изучено еще недостаточно. Однако следует признать, что фагоцитарная реакция макрофагов играет защитную роль против вирусных инфекций. Установлено, что вирусы, циркулирующие в крови животных, извлекаются оттуда макрофагами. Кроме того, эти клетки синтезируют интерферон, иммуноглобулины. Вируснейтрализующие антитела, Т-лимфоциты и макрофаги играют значительную роль в противовирусном иммунитете. При взаимодействии вируса со специфическими антителами происходит адсорбция антител на поверхности вируса, что приводит к блокированию вирусных рецепторов. В результате такой вирус не может адсорбироваться на чувствительной клетке и проникать в нее, — он оказывается нейтрализованным.

 

ВОПРОС

Большинство известных вирусов обладают способностью размножаться в курином эмбрионе (рис.4). Используют эмбрионы в возрасте от 8 до 14 дней в зависимости от вида вируса, способа заражения и задач исследования. Вирусы гриппа культивируются в 9-10, осповакцины - в 12, паротита - в 7-дневных куриных эмбрионах. Размножение вируса в куриных эмбрионах происходит в разных частях зародыша, что связано с особенностями тропизма вируса. Методику выращивания вируса в курином эмбрионе широко используют при промышленном культивировании.

Существует несколько способов заражения развивающегося куриного эмбриона: на хорионаллантоисную оболочку, в аллантоисную и амниотическую полости, желточный мешок, тело эмбриона.

Заражение на хорионаллантоисную оболочку применяется для выделения и культивирования вирусов, образующих на оболочках бляшки (вирусы вакцины, натуральной оспы, простого герпеса). Перед заражением яйца просвечивают с помощью овоскопа, карандашом очерчивают границу воздушного пространства и хорионаллантоисной оболочки. Поверхность яйца над воздушным пространством и в месте заражения протирают спиртом, прожигают, обрабатывают йодом и делают отверстие в полости воздушного мешка. На месте заражения скорлупу удаляют так, чтобы не повредить подскорлупную оболочку, которую затем прокалывают короткой стерильной иглой, чтобы не повредить хорионаллантоисную оболочку. Воздух из полости воздушного мешка отсасывают. Вирусный материал (0,05 - 0,2 мл) наносят на хорионаллантоисную оболочку туберкулиновым шприцем с короткой иглой или пастеровской пипеткой. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом или тем же выпиленным кусочком скорлупы и по краям заливают расплавленным парафином. Зараженные эмбрионы располагают на подставке горизонтально и инкубируют в термостате. Вскрытие эмбрионов производится не раньше 48 часов инкубации. На зараженной оболочке обнаруживаются беловатые непрозрачные пятна разной формы (бляшки).

Заражение в аллантоисную полость. Вирус, введенный в аллантоис, размножается в эндодермальных клетках, переходя затем в аллантоисную жидкость. Заражение осуществляют следующим способом: в скорлупе над воздушной камерой острием скальпеля или ножниц производят прокол, после чего через отверстие в вертикальном направлении вводят иглу со шприцем, которая проходит через хорионаллантоисную оболочку и попадает в аллантоисную полость, материал вводится в объеме 0,1 мл и отверстие заливают парафином.

Заражение в желточный мешок. С этой целью используют эмбрионы 5 - 10-дневного возраста. Наиболее употребительны два метода заражения. По первому материал вводится через воздушное пространство. В центре яйца делают отверстие, помещают его на подставку тупым концом вправо и через отверстие в вертикальном направлении вводят иглу, надетую на шприц, игла проходит через хорионаллантоисную оболочку, аллантоисную полость в желток. В желточный мешок можно ввести от 0,1 до 0,5 мл вируссодержащего материала. После заражения отверстие в скорлупе заливают парафином, и эмбрион помещают в термостат. По второму методу на границе воздушного пространства с той стороны, где лежит желток (стороны, противоположной от эмбриона), делают прокол скорлупы, через который вводят инфекционный материал. Направление иглы должно быть к центру яйца.

Куриный эмбрион, инфицированный вирусным материалом, ставят в инкубатор на 2—3 дня, в зависимости от характера внесенного вируса. Для развития вирусов из проб, взятых у больного (например, смывов из носоглотки, использующихся при диагностировании гриппа), куриный эмбрион представляет хорошую среду. По типу изменений, скажем в тканях хорионаллантоисной оболочки, можно непосредственно определить, с каким вирусом мы имеем дело. Очень характерные изменения дают вирусы оспы и герпеса. Некоторые вирусы очень интенсивно размножаются в различных тканях куриного эмбриона и дают исходный материал для приготовления вирусных антигенов, необходимых при лабораторной диагностике вирусных заболеваний. Вирусы, размноженные в курином эмбрионе, были использованы как исходный материал для получения восемнадцати видов прививочных вакцин.

Несмотря на положительные стороны культур клеток, получивших столь широкое распространение в современных вирусологических лабораториях, куриный эмбрион во многих случаях сохранил свое первенствующее значение и по-прежнему служит классическим материалом для работы.

Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбриона, положительной реакции гемагглютинации на стекле с аллантоисной или амниотической жидкостью, по образованию фокусных поражений («бляшек») на хорион-аллантоисной оболочке, а также в РГА.

ВОПРОС: СМ. ТЕТРАДЬ

ВОПРОС

Выбор экспериментальных животных определяется целью работы и видовой чувствительностью к изучаемому вирусу. Для заражения используют обезьян, кроликов, морских свинок, хомячков, белых крыс и мышей. Лабораторных животных заражают различными способами в зависимости от тропизма вируса к определенным тканям. Так, например, для культивирования нейротропных вирусов заражение производят преимущественно в мозг (вирусы бешенства, клещевого энцефалита и др.), культивирование респираторных вирусов осуществляется при интраназальном инфицировании животных (вирусы гриппа), дерматотропных (вирус оспы) - путем накожного и внутрикожного заражения. Наиболее часто используются накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное и внутримозговое заражение. При первичном заражении животные могут не заболеть, поэтому через 5-7 дней внешне здоровых животных выводят из эксперимента, а из их органов готовят суспензии, которыми заражают следующие партии животных. Эти последовательные заражения называются «пассажами».

Индикацию, т.е. обнаружение факта репликации вируса, устанавливают на основании развития типичных признаков заболевания, патоморфологических изменений органов и тканей животных или положительной реакции гемагглютинации (РГА). РГА основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов различных видов животных, птиц и человека за счет поверхностного вирусного белка - гемагглютинина. В настоящее время использование животных для культивирования вирусов ограничено, в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных научных целях.

ВОПРОС

Растворы. Наиболее широко используют при работе с культурами клеток растворы Хенкса и Эрла, которые готовят на бидистилли-рованной воде с добавлением различных солей и глюкозы.

Раствор Хенкса: на 1 л бидистиллированной воды 8,0 rNaCl, 0,4 г КС1, 0,1 г MgSO₄-7H₂O, 0,14 г СаС1₂, 0,06 г КН₂РО₄, 0,06 г NaH₂PO₄, 1,0 г глюкозы, 0,02 г фенолрота, 0,07 г NaHCO_v

Раствор Эрла: на 1 л бидистиллированной воды 6,8 г NaCl, 0,4 г КС1, 0,1 г MgSO₄, 0,2 г СаС1₂, 0,125 г NaH₂PO, 2,2 г NaHCO₃, 1,0 г глюкозы.

Эти сбалансированные солевые растворы используют для приготовления всех питательных сред, так как они обеспечивают сохранение рН, осмотическое давление в клетках и соответствующую концентрацию необходимых неорганических веществ. Кроме того, их применяют при различных манипуляциях с культурой клеток (отмывание от ростовых сред, разведение вируса и т. д.).

При культивировании клеток применяют диспергирующие растворы трипсина и версена. Раствор трипсина (0,25%-ный на фосфатном буфере) используют для разделения кусочков тканей на отдельные клетки и для снятия слоя клеток со стекла. Раствор версена – натриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (0,02%-ный на растворе Хенкса) – используют для снятия клеток со стекла. Все растворы стерилизуют при соответствующих режимах.

10.5 Питательные среды. Различают естественные и искусственные (синтетические и полусинтетические) питательные среды.

Естественные среды состоят из смеси солевого раствора (Хенкса, Эрла), сыворотки крови (животных или человека), тканевого (эмбрионального) экстракта (эмбрионов кур, коров, человека), коровьей амниотической жидкости и т. д. Количество каждого компонента в разных примесях сред значительно варьирует. Используют эти среды редко.

В настоящее время применяют в основном искусственные питательные среды. К полусинтетическим питательным средам относят ферментативные гидролизаты различных белковых продуктов: гидролизат лактальбумина, мышечный ферментативный гидролизат, фермснтативно-казеиновый дрожжевой гидролизат, гемогидролизат, аминопептид и др. Наиболее широко используют в вирусологической практике 5%-ный раствор гидролизата лактальбумина, 5%-ный и 2,5%-ный раствор гемогидролизата.

Из синтетических сред наиболее широкое применение нашли среда 199 и среда Игла. В состав среды 199 входит более 60 компонентов: 20 аминокислот, 17 витаминов, компоненты нуклеиновых кислот, источники липидов, 8 минеральных солей и другие вещества. В состав среды Игла также входит не менее 60 компонентов, включающих аминокислоты, витамины, углеводы и т.д.

Во все питательные среды и некоторые солевые растворы добавляют индикатор феноловый красный (0,002 %) для определения концентрации водородных ионов (рН). В принятой концентрации он не оказывает токсического воздействия на клетки и вирусы. При снижении рН среда желтеет, что позволяет определять момент ее закисле-ния продуктами метаболизма клеток до уровня, требующего замены среды на свежую; при сдвигах рН в щелочную сторону растворы принимают красно-малиновый цвет. При нейтральном значении рН (7,2– 7,4) цвет среды оранжево-красный. Для регулирования рН солевых растворов и питательных сред используют 7,5%-ный раствор бикарбоната натрия (NaHCO₃) и 3%-ный раствор уксусной кислоты (СН₃СООН). Для уничтожения микрофлоры перед использованием в среды добавляют антибиотики: пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД/мл. Для подавления плесени используют натриевую соль нистатина по 100 мкг на 1 мл среды.

Все питательные среды принято делить на две группы:

- ростовые, обеспечивающие жизнь и размножение клеток. Они содержат 2–10 % сыворотки крови, применяются в первые дни культивирования клеток;

- поддерживающие, обеспечивающие жизнедеятельность клеток, но не размножение их. Они не содержат сыворотки крови, используются обычно после заражения культуры клеток вирусами.

Сыворотка крови крупного рогатого скота – обязательный компонент ростовых питательных сред. В ее состав входит ряд биологически активных веществ, необходимых для роста клеток in vitro. Содержащиеся в сыворотке активная фракция альбуминов и фетуин способствуют прикреплению клеток к поверхности стекла. В практической работе наибольшее применение нашли сыворотки как взрослого крупного рогатого скота, так и телят, получаемые на мясокомбинатах. Самая лучшая сыворотка для культуры клеток – сыворотка эмбрионов коров. При получении сыворотки следует соблюдать строгую стерильность. Каждая серия сыворотки проходит контроль на стерильность и токсические свойства по отношению к культурам клеток.

ВОПРОС

Диплоидные культуры клеток. Международный комитет по клеточным культурам дал следующее определение диплоидным клеткам: это морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная в процессе культивирования in vitro, имеющая ограниченный срок жизни, характеризующаяся тремя фазами роста, сохраняющая в процессе пассирования кариотип, свойственный исходной ткани, свободная от контаминантов и не обладающая туморогенной активностью при трансплантации хомячкам.

Диплоидные культуры клеток, так же как и перевиваемые, получают из первичных культур клеток. Кариотип клеток очень лабилен и при обычных методах культивирования клеток он изменяется в первые дни. Поэтому потребовались специальные методы обработки ткани, высокого качества питательные среды, фетальная сыворотка для длительного поддерживания клеток in vitro в диплоидном состоянии. Эту задачу впервые успешно решили американские ученые Хейфлик и Мурхед (1961).

Диплоидные клетки получены из различных тканей эмбриона человека (легкие, почки, кожно-мышечная ткань, сердце и др.) и животных (почка эмбриона крупного рогатого скота, свиней, ВНК-21 – почка хомяка и др.).

Диплоидные клетки в отличие от перевиваемых имеют ограниченные возможности пассирования. Максимальное число пассажей 50±10, затем количество делящихся клеток резко уменьшается и они гибнут. Однако диплоидные клетки могут быть использованы в течение длительного времени, так как при каждом пассаже часть клеток можно заморозить (минус 196 °С) и при необходимости восстановить.

Диплоидные клетки имеют преимущества перед перевиваемыми и первичными клетками: 10–12 дней они могут быть в жизнеспособном состоянии без смены питательной среды; при смене среды один раз в неделю остаются жизнеспособны в течение 4 нед; особенно пригодны для длительного культивирования вирусов, у них сохранена чувствительность исходной ткани к вирусам.

ВОПРОС: СМ. ТЕТРАДЬ

ВОПРОС: СМ. ТЕТРАДЬ

ВОПРОС

Первично-трипсинизированные культуры клеток – клетки, полученные непосредственно из органов или тканей организма, растущие in vitro в один слой (рис. 26). Культуру клеток можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного (взрослого или эмбриона). Однако лучше это удается сделать из эмбриональных органов, так как клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для этих целей используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы эмбрионов или молодых животных.

Для получения первичных клеток от здорового животного не позднее 2-3 ч после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают их на кусочки (1-4 мм) и обрабатывают ферментами: трипсином, панкреатином, коллагеназой и другими (чаще трипсином). Ферменты разрушают межклеточные вещества, полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37 °С.

Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делиться. В развитии культур клеток различают несколько фаз: адаптации, логарифмического роста, стационарную и старения (гибель клеток). Размножаясь, клетки размещаются на поверхности стекла и при полном покрытии его в один слой контактируют друг с другом и прекращают делиться (контактная ингибиция). На стекле формируется слой толщиной в одну клетку (поэтому эти культуры клеток называют однослойными или монослойными).

Обычно монослой формируется через 3–5 дней. Скорость его формирования зависит от вида ткани, возраста животного, качества питательной среды, посевной концентрации клеток и других факторов.

Питательную среду меняют по мере загрязнения ее продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохраняет жизнеспособность в течение 7–21 дня (в зависимости от вида клеток и состава питательной среды).

Интенсивность размножения клеток и состояние монослоя контролируют визуально под малым увеличением микроскопа (объектив х10). Лучше для этой цели использовать инвертированный микроскоп.

Для культивирования вирусов используют молодые культуры клеток (как только сформировался монослой).

ВОПРОС: СМ.ТЕТРАДЬ

ВОПРОС

Патологический материал необходимо брать стерильными инструментами в стерильную посуду. Поверхность органа (ткани), от которого берут патологический материал, на месте разреза следует обжечь над пламенем или прижечь нагретой металлической пластинкой.

Патологический материал должен быть взят как можно раньше после смерти животного, особенно в теплое время года, т.к. сразу же после заболевания (или впервые же 1-2 дня) барьерная роль кишечника значительно ослабевает, что наряду с повышенной проницаемостью кровеносных сосудов способствует диссиминации кишечной флоры.

Кроме того, по мере углубления инфекционного процесса количество вируса может снижаться в результате одновременного воздействия защитных сил организма.

Следует учитывать, что при многих вирусных инфекциях наблюдается феномен посмертной аутостерилизации, в результате чего вирус может быть вообще не обнаружен или его количество окажется очень незначительным.

Вторая причина необходимости экстренного взятия материала – избежать посмертных изменений в тканях, иначе они могут оказаться непригодными для бактериологических и вирусологических исследований.

Для вирусологических исследований желательно направлять пробы от животных в трех стадиях болезни:

· от больных с выраженной клиникой с указанием температуры, частоты пульса и дыхания (кровь, кость, лимфатические узлы и пораженные органы);

· от убитых в агонии (кровь, кость, лимфатические узлы и пораженные органы);

· от выздоравливающих животных (кровь).

Взятые пробы следует как можно быстрее поместить в условия, обеспечивающие замедление процессов разложенияматериала. Такие условия обеспечивают низкие температуры.

Если патологический материал невозможно доставить в лабораторию в течение ближайших 24-30 часов, его посылают только в консервированном виде.

Патологический материал (органы или их части) консервируют 30-50%-ным раствором химически чистого глицерина на физиологическом растворе. Физиологический раствор предварительно стерилизуют при 120⁰С в течение 30 мин.

Материал можно консервировать также в стерильном вазелиновом масле. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве 4-5 раз, превышающем его объем. Консервированные образцы желательно хранить в холодильнике.

Небольшие трупы (поросят, мелких животных можно посылать целиком во влагонепроницаемой таре).

Трубчатые кости посылают на исследование в целом виде, очищенными от мышц и сухожилий. Кости завертывают в марлю или полотно, смоченные дезинфицирующей жидкостью и пересылают в сейф - пакетах или в стерильных полиэтиленовых пакетах.

Кишечник перед посылкой для бактериологического и вирусологического исследований освобождают от фекальных масс, а концы кишечника перевязывают. На исследование посылают части кишечника с наиболее характерными патологическими изменениями.

Кишечник помещают в банки с 30%-ным водным раствором глицерина или насыщенным водным раствором поваренной соли. Объем консервирующей жидкости должен превышать объем взятого материала в 4-5 раз.

Кал для исследования отправляют в стерильных стаканах, пробирках, банках, которые закрывают пергаментной бумагой, пробками или в контейнерах.

Кал от трупов животных можно послать в отрезке невскрытого кишечника, завязанного с обоих концов, он должен быть доставлен в лабораторию не позднее 24 ч после его взятия.

Для исследования участков кожи берут наиболее пораженные ее кусочки размером 10x10 см и посылают в стерильной, герметически закупоренной посуде.

При взятии содержимого гигром (бурс) в области поражения выстригают шерсть, кожный покров дезинфицируют 70°-ным спиртом и обрабатывают 5%-ной настойкой йода. Затем стерильным шприцем с иглой большого диаметра делают пункцию, отсасывают содержимое гигромы и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.

Перед взятием проб молока у коров вымя обмывают теплой водой, соски обрабатывают 70%-ным спиртом. Из каждой доли вымени берут последние порции молока по 10-15 мл в отдельные стерильные пробирки с резиновыми пробками.

У овец и коз пробы молока берут с помощью молочного катетера или путем пункции цистерны вымени. Для этого животное фиксируют в боковом положении, вымя у основания соска протирают 70%-ным спиртом или смазывают 5%-ной настойкой йода. Стерильным шприцем с иглой делают пункцию у основания соска. После попадания иглы в цистерну (о чем судят по свободному движению конца иглы) набирают в шприц молоко и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.

Пробы мочи берут катетером в стерильную посуду. При его отсутствии мочу получают при естественном мочеиспускании или, вызывая последнее, раздражением наружных половых органов.

Пробы слизи из половых органов животных берут стерильным марлевым тампонам (см. приложение) при помощи специальных инструментов конструкции Павловского, Жавордова, Казеева, а также применяемых при искусственном осеменении коров шприца-катетера или полистироловой пипетки, соединенной со шприцем.

Для получения смывов слизистой оболочки носовой полости, половых органов, конъюнктивы и др. полость орошают стерильным физиологическим раствором или солевым раствором Хенкса (см. приложение) и собирают стекающий раствор в емкости.

Иногда для получения смывов в полость вводят стерильный ватный тампон, смоченный физиологическим или солевым сбалансированным раствором. Тампоном тщательно протирают слизистую, извлекают его и помещают во флаконы с аналогичным раствором.

Мазки из носа, полости рта, прямой кишки, клоаки у птиц и т.д. берут при помощи стерильных ватных тампонов на довольно длинных стерильных деревянных палочках. После взятия мазка тампон помещают в пробирку, заполненную соответствующей жидкостью.

Наиболее часто для этого используют реактив Хенкса с антибиотиками (пенициллин, стрептомицин, нистатин) и белковым стабилизатором, например с 0,5% желатина или 0,5-1% альбумина бычьей сыворотки.

ВОПРОС

Перевиваемые культуры клеток – это клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лабораториях их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в другой (при условии замены питательной среды).

Получают перевиваемые клетки из первичных культур клеток с повышенной активностью роста путем длительных пересевов в определенном режиме культивирования. Обычно работа по получению новых клеточных линий продолжается несколько месяцев. Полагают, что механизм происхождения перевиваемых культур клеток – результат генетической изменчивости клеток или селекции единичных клеток, присутствующих в первичной исходной культуре.

Клетки перевиваемых культур имеют одинаковую форму, гетероплоидный набор хромосом (у первичных клеток он диплоидный), стабильны в условиях роста in vitro, некоторые из них обладают онкогенной активностью. Последнее свойство ограничивает использование перевиваемых культур клеток для культивирования вирусов при производстве вакцин.

Перевиваемые культуры клеток можно получать как из здоровых тканей животных, так и из опухолевых. Среди них наиболее широко используют следующие линии клеток: HeLa (из раковой опухоли шейки матки женщины); Нер-2 (из карциономы гортани человека); KB (из раковой опухоли полости рта); ВНК-21 (почка новорожденного хомячка); ППЭС (перевиваемая почка эмбриона свиньи); ППТ (перевиваемая почка теленка); ППО (перевиваемая почка овцы); TR (из слизистой трахеи коровы); L (мышиные фибробласты); СОЦ (из сердца обезьяны циномольгус) и др.

Перевиваемые клетки имеют преимущества перед первичными: их приготовление значительно проще, экономятся труд и материальные средства; эти культуры заранее можно проверить на наличие латентных вирусов и микрофлоры; клональные линии обеспечивают более стандартные условия для размножения вирусов, чем первичные, представляющие смешанную популяцию клеток. Большинство перевиваемых клеток обладает более широким спектром чувствительности к вирусам, чем соответствующие первичные культуры.

Однако перевиваемые клетки имеют и недостатки: они склонны к малигнизации, т. е. злокачественное перерождение независимо отпроисхождения и снижения чувствительности к вирусам у них происходит быстрее, чем у первичных, поэтому необходимо применять клональные линии перевиваемых клеток.

Поддерживают перевиваемые клетки путем периодических пересевов. Чаще используют бесцентрифужный метод. Для очередного пересева отбирают 2–3-дневную культуру с хорошим монослоем, сливают питательную среду, а клеточный монослой покрывают подогретым до 35-37°С 0,02%-ным раствором версена. Диспергирующее действие версена объясняется связыванием им двухвалентных катионов (Mg⁺⁺, Ca⁺⁺), которые способствуют прикреплению клеток к стеклу и обеспечивают целостность клеточной культуры. Под действием версена клетки округляются, отделяются от стекла.

Через 10–15 мин после округления клеток версен сливают, оставляя небольшое количество его (в 1-литровом матрасе – 5-–10 мл, в 0,1-литровом – 2–3 мл), и выдерживают еще 5–10 мин, периодически омывая клетки версеном, затем добавляют небольшое количество питательной среды. После встряхивания подсчитывают клетки в камере Горяева, исходную клеточную взвесь разводят ростовой питательной средой до необходимой концентрации (80–200 тыс. в 1 мл) и разливают при помешивании в пробирки или матрасы, закрывают резиновыми пробками и культивируют в термостате при 37 °С в течение 3–4 дней до образования сплошного монослоя. Обычно клетки в камере Горяева не подсчитывают, а пересевают с коэффициентом от 1:2 до 1:6 в зависимости от вида клеток. Состав питательной среды также зависит от вида клеток, но чаще при культивировании перевиваемых клеток используют среды Игла, 199 или смеси этих сред с гидролизатом лактальбумина.

Важно отметить, что при поддержании перевиваемых клеток путем их систематического пересева в лаборатории оставляют не менее одного матраса без пересева на случай непригодности последнего пассажа.

ВОПРОС

Для обнаружения вируса чаще всего используют экспресс-методы, которые позволяют в материале:

1. обнаружить вирусные белки (антигены), для этой цели используют серологические реакции: РИФ, ИФА, РНГА, РСК, РДП;

2. обнаружить вирусные нуклеиновые кислоты с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или ДНК-зонда;

3. обнаружить вирионы вирусов. Электронная микроскопия позволяет обнаружить вирусы любых размеров, а крупные вирусы (вирусы оспы) можно увидеть под световым микроскопом. Этот метод называется вирусоскопия.

Электронная микроскопия используется в основном в исследовательских целях. Электронный микроскоп – сложный и дорогой прибор, в диагностических ветеринарных лабораториях его нет. Хотя исследование с его помощью - очень эффективный экспресс-метод при диагностике рота-, коронавирусных и других инфекций. Если в материале содержится не менее 10-7 вирионов на 1мл, он не требует дополнительных методов очистки концентрации;

4. Обнаружить тельца – включения под световым или люминесцентным микроскопом.

Тельца-включения – это внутриклеточные включения, образующиеся в клетках при репродукции в них некоторых вирусов. По природе они представляют собой либо скопления (колонии) вирионов, либо измененный под действием вируса клеточный материал, либо комбинацию первого со вторым. Тельца-включения могут находиться в цитоплазме (чаще это РНК-содержащие вирусы) или в ядре (чаще это ДНК-содержащие вирусы, кроме вируса оспы), или в цитоплазме и ядре клетки (вирус чумы собак). Тельца-включения, образуемые некоторыми вирусами, получили специальное название, так, тельца-включения при оспе кур называются тельцами Боллингера, при чуме плотоядных – Ленца, при бешенстве Бебеша-Негри и др. При обнаружении телец Бебеша-Негри в мазках головного мозга погибшего животного наличие бешенства считается доказанным. При других вирусных инфекциях обнаружение телец-включений имеет лишь вспомогательное диагностическое значение;

5. обнаружить вирусные гемагглютинины, которые являются белками некоторых вирусов (орто-, парамиксовирусов и др.).

Гемагглютинирующие вирусы способны аггютинировать эритроциты животных определенных видов в условиях соответствующих температуры и рН среды. Иногда используют реакцию гемагглютинации (РГА) для обнаружения гемагглютинирующего вируса в материале;

6. для обнаружения вируса в активной форме (инфекционной) используют довольно длительные вирусологические исследования. С этой целью применяют метод биопробы на живых чувствительных к предполагаемому вирусу системах: лабораторных животных, куриных эмбри