По виконанню практичної роботи

1. Перещеплювальна культура клітин Vero

Для культивування вірусів, в лабораторній практиці використовують різноманітні культури кліин. В демонстраційному препараті студент повинен побачити Походження клітин – нирка зеленої мавпи. До цієї культури клітин чутливі віруси Коксакі В (1-6), поліовіруси (1-3), арбовіруси, реовіруси, вірус везикулярного стоматиту, вісповакцини, простого герпесу.

 

Цитопатична дія поліовірусу (ІІ) на культурі клітин Vero

Досліджуваний матеріал, в якому припустимо знаходиться цікавлячий нас вірус, суспендують в невеликому об’ємі культурального середовища, фільтрують через міліпоровий фільтр для видалення бактерій і вносять в культуральний флакон, який містить моно-шарову культуру сприйнятливих клітин. Через 48 – 72 години реєструють появу змін. Простим оком видно повну чи часткову деградацію моношару і його злущування з поверхні флакона. Морфологічні зміни клітин виявляють за допомогою інвертованого мікроскопа.

Під час розмноження вірусу поліомієліту (ІІ типу), в даній культурі клітин, відзначають характерну цитопатичну дію за типом повної дегенерації моношару клітин: клітини, що містять вірус, кругліші, зморшкуваті, у ядрах відбуваються пікнотичні зміни.

 

 

Середовище 199, Ігла та інші

Середовище 199 – синтетичне середовище, яке включає біля 60 компонентів. Застосовується для культивування перещеплювальних та первинно-трипсонізованих культур клітин.

Середовище Ігла – містить мінімальний набір амінокислот (13) і вітамінів (8). Застосовується для культивування диплоїдних та перещеплювальних культур клітин.

Курячі ембріони. Овоскоп.

Для виділення деяких вірусів застосовуються курячі ембріони від 5 до 12-14 діб. При цьому вік використовуваних ембріонів, засіб зараження та строки одержання максимальної кількості вірусів (час інкубації) залежить від біологічних властивостей культивованих вірусів та їх тропізму. Перед зараженням курячі ембріони овоскопують для визначення їхньої життєздатності. Ознаки живого ембріона – наявність самостійних рухів, добре виражений судинний малюнок, пульсація судин.

Існує кілька способів зараження курячих ембріонів:

· у порожнину амніона й алантоїсу;

· на хоріоналантоїсну оболонку;

· в жовчний мішок.

 

РНГА з парними сироватками для діагностики герпетичної інфекції

РНГА оцінюється за наявністю чи відсутностю аглютинації еритроцитів. Приріст антитіл відмічають при одночасному титруванні парних сироваток, які були взяті в перші дні захворювання (або імунізації) та на 15-20 добу від початку захворювання (або закінчення імунізації). Діагностичне значення має виявлення 4-кратного та більше збільшення титру антитіл в другій сироватці.

Врахуйте результат, оформте протокол, зробіть висновки.

Протокол дослідження

Досліджувана особа	День обстеження	Розведення сироватки хворого
1/20	1/40	1/80	1/160	1/320	1/640	К
Хворий А.	2-й
15-й

ПРИКЛАДИ ТЕСТОВИХ ЗАВДАНЬ:

1. При спалаху гострої респіраторної інфекції з метою встановлення діагнозу грип проводиться ескпресс діагностика, яка грунтується на виявленні специфічного вірусного антигену в досліджуваному матеріалі (змив з носоглотки). Яку серологічну реакцію використовують для цього?

*А. Реакція імунофлюоресценції.

В. Реакція зв‘язування комплементу.

С. Реакція аглютинації.

Д. Реакція преципітації.

Е. Реакція опсонізації.

2. Природні кілери (NK) відіграють суттєву роль в протипухлинному і противірусному захисті організму. При взаємодії NK-клітини з клітиною-мішенню остання руйнується. Вкажіть механізм загибелі клітини-мішені.

А. Комплементзумовлений цитоліз

*В. Апоптоз

С. Фагоцитоз

Д. Дія фактору некрозу пухдин

Е. Дія лімфотоксину

3. У вірусів:

*А. Можут бути ферменти реплікації

*В. Можут бути ферменти транскрипції

*С. Можливий синтез вірусних РНК- та ДНК-полімераз в клітині

Д. Капсид складається з двошарової клітинної мембрани

Е. Ферментативну активність вивчають середовищах Гісса

4. Проникнення вірусної НК в клітину

*А. Може привести до включення її в хромосому клетини-хозяїна

В. Завжди призводить до негайного розмноження вірусних часток

С. Завжди призводить до лізису клетини

*Д. Може привести до неопластичної трансформації клітини

E. Не змінює антигені властивості клітини

5.У пологовому будинку виник спалах кору. Можна вважати, що діти, матері яких раніше перехворіли на кір, не захворіють. Антитіла якого класу забезпечать захист новонароджених від захворювання в цьому випадку?

*А.IgG

B. IgМ

C. IgA

D. IgE

E. IgD

6.Для створення штучного активного противірусного імунітету необхідно використати препарат, одна з найважливіших характеристик якого вказана серед відповідей. Виберіть цю харатеристику.

А. Одержаний шляхом імунізації коней

В. Одержаний з клонів гібридом

С. Містить специфічні антитіла

Д. Містить імуноглобулінову фракцію сироватки

*Е. Містить антигени збудника

7. Яким чином можна виявити наявність вірусу в інфікованій культурі клітин?

*А. За цитопатичними змінами в культурі клітин

*В. За здатністю цитоплазматичної мембрани інфікованих клітин адсорбувати еритроцити

*С. Виявленням вірусних протеїнів в моношарі інфікованих клітин

Д. Виявленням зміни поживних потреб інфікованих клітин

8. З якими найбільш важливими факторами пов‘язана несприятливість до інфікування патогенними вірусами?

А. Внутрішньовидова резистентність

В. Несприйнятливість до повторного інфікування

*С. Проведення вакцинопрофілактики

Д. Формування імунного прошарку

9. Вірусні ураження можуть проявлятися у вигляді продуктивних, абортивних, латентних та інапаратних інфекцій. Які віруси здатні викликати персистуючий перебіг інфекційного процесу?

А. Високовірулентні віруси

В. Значно змінюють метаболізм клітини

С. Ті що інфікуюють нечутливі клітини

Д. Віруси, що виходять з клітини брунькуванням

Е. Дефектні віруси

10. Основні фактори противірусного захисту організму людини:

*А. Інтерферони

В. Лізоцим

*С. Віруснейтралізуючі антитіла

Д. Т-ефектори (ГСТ)

*Е. Т-ефектори (кілери)

Додаток А

(довідковий)

ПОЯСНЕННЯ ДО ТЕМИ:

„Структура, класифікація та особливості життєдіяльності вірусів. Методи лабораторної діагностики вірусних інфекцій та їх особливості. Особливості противірусного імунітету”.

Місце вірусів в системі живих організмів	Царство Vira
Рівень морфологічної організації вірусу	Доклітинна (молекулярна) форма життя
Стурктурні компоненти вірусу	ДНК або РНК Капсид Суперкапсид (у окремих віріонів)
Основна структурна особливість вірусів, що відрізняє їх від всіх інших живих істот	Наявність тільки однієї нуклеїнової кислоти
Структура капсиду	Білкова оболонка, що складається з субодиниць, що повторюються – капсомерів
Групи вірусів по розташуванню капсомерів (типи симетрії)	Спиральний Кубичний Комбінований Сферична Паличкоподібна Сперматозоїдна Кубоїдальна
Основні методи вивчення морфології вірусів	Електронна мікроскопія Рентгеноструктурний аналіз
Можливі способи визначення розміру вірусу	Фільтрування через дрібнопористі фільтри Ультрацентрифугування Фотографування в електронному мікроскопів
Біологічні властивості, що зближують віруси з рикетсіями	Облігатний внутрішньоклітинній паразитизм
Деякі особливості вірусів	1 Можуть інфікувати тканини, не викликаючи запальний процес. 2 Можуть реплікватися к клітинах протягом їх життя та не спричиняти ураження. 3 Інколи порушують деякі спеціалізовані функції клітини, не викликаючи порушення цілого організму. 4 Іноді викликають руйнування тканин, а потім повністю зникають з організму
Принципове відрізнення характеру внутріклітинного паразитизму вірусів від рикетсій	Генні паразити
Спосіб розмноження вірусу	Диз’юктивний (окремий синтез нуклеїнової кислоти і капсида з наступною збіркою)
Внутрішньоклітинні включення при вірусних інфекціях	Скопичення вірусів, що оточені реактивними змінами клітини
Причина не можливості виявлення вірусів (за рідким виключенням) в світовому мікроскопі	Розміри вірусів менш ніж дозволяюча здатність мікроскопу
Роль нуклеїнових кислот вірусу	Носії спадкової інформації Інфекційність – забезпечення репродукції вірусних структур
Роль капсиду та суперкапсиду	Захисна Антигенність Формоутворення
Механізми ухилиння вірусів від імунної реакції	Антигенна мінливість (наприклад, антигенний дрейф, антигенний шифт)
Персистенція віруса	Це характерна риса певних вірусних інфекцій. Якщо в імуноскопроментованому організсі не розпізнається вірус, то розвивається повільноперебігаюча вірусна інфекція и персистентна наявність віруса, анприклад при гепатиті В
Латентний стан віруса	Обумовлений тим, що, вбудовуючись в геном клітини, вірус не експресує на мембрани клітини свої антигени
Імунітет при вірусних інфекціях (визначення)	Спосіб захисту генетичного гомеостазу організму
Механізми захисту організму від вірусів	Гуморальні Клітинні Патофізіологічні
Специфічні гуморальні механізми нейтралізації вірусу	IgG та IgM-сироваткові IgА-секреторні
Неспецифічні гуморальні механізми захисту від вірусу	Інгібітори Лізоцим, комплемент Інтерферон
Неспецифічні клітинні механізми захисту при вірусних інфекціях	Фагоцитоз інфікованих клітин Резистентність клітин у зв'язку з втрачанням рецепторів Регенерація стійких до вірусів клонів клітин
Властивості інтерферону	Білок з молекулярною масою 30 000 Дальтон Неспецифічний по відношенню до вірусів Володіє тканевою, видовою специфічністю
Механізм дії інтерферону	Порушення трансляції вірусної РНК Припинення синтезу вірусного білка
Патофізіологічні механізми захисту при вірусних інфекціях	Бар'єри (шкіра, слизові) Підвищення температури, ацидоз, гіпоксія Секреція та екскреція Відторгнення частини цитоплазми з вірусом Внутрішньоклітинні включення та їх евакуація
Для обмеження дисимінації любого віруса та попередження реінфекції, імунна відповідь повинна	1 Бути здатною припинити проникнення віріонів в клітини. 2 Знешкодити всі вірусінфіковані клітини, щоб знизити розповсюдження віруса
Принципи лабораторної діагностики вірусних інфекцій	Пошук антигену (збудника) Пошук специфічних змін (антитіл)
Вибір методу діагностики вірусної інфекції	Вибір методу діагностики залежить від характеру вірусної інфекції, властивостей збудника та вирішується в кожному окремому випадку в залежності від патогенеза, періоду захворювання, дослідного матеріалу та можливостей лабораторії
Вірусоскопічний метод діагностики	Візуальне виявлення віруса або внутрішньоклітинних включень безпосередньо в дослідному матеріалі за допомогою електронної або світлової мікроскопії. До нього приєднуються електрономікроскопія та імунофлюоресценція
Вірусологічний метод діагностики захворювання	Виділення вірусу з клінічного матеріалу шляхом зараження культур клітин, курячих ембріонів, лабораторних тварин з наступною ідентифікацією віруса
Серологічний метод діагностики вірусної інфекції	Заснований на виявленні специфічних антитіл в сироватці крові хворої людини
Молекулярно-генетичний метод діагностики вірусних інфекцій	Дозволяє виявити у клінічному матеріалі специфічні фрагменти вірусної РНК або ДНК за допомогою молекулярної гібридизації або ПЛР
Рання діагностика вірусних інфекцій	проводиться в перші дні захворювання шляхом виявлення в дослідному матеріалі вірусів, внутрішньо-клітинних включень, вірусних антигенів або нуклеїнових кислот вірусів різними методами, в першу чергу експрес-методами діагностики
Ретроспективна діагностика вірусних інфекцій	Дає можливість встановити діагноз в пізні строки захворювання або після видужання. Діагноз становлять за допомогою серологічної реакції, визначаючи наростання титру специфічних противірусних антитіл в парних сироватках крові хворого, взятих в перші дні та пізніші строки захворювання
Експрес-методи діагностики вірусних інфекцій	Світлова мікроскопія пофарбованих мазків-відбитків з ураженої тканини з метою виявлення внутрішньоклітинних включень (сказ, герпес, цитомегалія, грип тощо). Електронна мікроскопія клінічних матеріалів в препаратах, оброблених негативним контрастуванням (рота вірусна інфекція, цитомегалія тощо). Імунна електроноскопія (ІЕМ), заснована на взаємодії доданих до дослідного матеріалу специфічних противірусних антитіл з вірусами, що знаходяться в матеріалі, при цьому утворюються скопичення вірусів, які виявити значно легше, ніж окремі віруси. Імунофлюоресцентний метод прямий та непрямий широко використовують в діагностиці різних захворювань. Імуноферментний аналіз (ІФА) використовують для виявлення вірусних антигенів та проти вісних антитіл, використовують різноманітні варіанти постановки ІФА. Радіоімунологічний аналіз (РІА) є однією з найбільш чутливих реакцій, яка дозволяє виявити мінімальну кількість іскомих антигенів або антитіл. Імуноблотинг – екскпес-метод, що дозволяє одночасно визначити в дослідних сироватках спектр антитіл до певних білків вірусів (їх антигенним фракціям) або вивити присутність вірусних білків-антигенів в патологічному матеріалі за допомогою діагностичних сироваток (моноклональних антитіл). Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) – молекулярно-генетичний метод дослідження, що дозволяє виявити присутність в клінічному матеріалі наявність мінімальної кількості специфічних фрагментів вірусної РНК або ДНК з певною нуклеотидною послідовністю і тим самим діагностувати природу вірусної інфекції
Наслідок введення вірулентного вірусу в культуру клітин	Цитопатична дія (ЦПД)
Наслідок введення вірулентного вірусу в курячий ембріон	Загибель ембріону
Наслідок введення вірусу піддослідній тварині	Розвиток клінічних симптомів Загибель тварини
Принцип ідентифікації вірусу	Нейтралізація вірусу специфічною імунною діагностичною сироваткою
Вірус+специфічна імунна сироватка+ культура клітин	Затримка цитопатичної дії
Інгредієнти реакції затримки гемаглютинації для ідентифікації вірусу	Вірус, що досліджується Специфічна імунна сироватка Еритроцити
Інгредієнти кольорової проби для ідентифікації вірусів	Вірус (що досліджується) Імунна сироватка Культура клітин в середовищі 199
Принцип виявлення антитіл при вірусних інфекціях	Нейтралізація (зв’язування з антитілами антигенів вірусу)
Інгредієнти реакції затримки гемаглютинації для виявлення антитіл	Досліджувана сироватка Вірусний діагностикум Еритроцити
Інгредієнти реакції нейтралізації на тварині для пошуку антитіл	Сироватка хворого Вірусний діагностикум Піддослідна тварина
Спеціальні реакції для експрес-діагностики	Імуноферментний аналіз адіо імунний аналіз Імуноелектрофорез
Спеціальна реакція для пошуку антитіл до окремих білків вірусу	Імуноблотинг
Інгредієнти реакції імуноблотингу для пошуку антитіл	«Стрип» с з нанесеними антигенами Сироватка хворого Антиглобулінова сироватка, мічена ферментом Субстрат на фермент, індикатор
Інгредієнти імуноферментного аналізу для пошуку антитіл	Тест-планшет (щільна фаза) з нанесеним антигеном Сироватка хворого Антиглобулінова сироватка, мічена ферментом Субстрат на фермент, індикатор
Препарати, що використовуються для специфічної профілактики та імунотерапії вірусних інфекцій	Для активної профілактики вірусних інфекцій зараз використовують вакцини: · живі – складаються з непатогенних збудників як природних (вірус коров’ячої віспи), так і отриманих штучно методом атенуації вірусів; · інактивовані - містить повний набір антигенів збудника. Для їх отримання віруси ін активують хімічними препаратами або фізичними чинниками, які забезпечують збереження структури проективних антигенів і, в той же час, надійно ін активують віруси; · хімічні вакцини – уявляють собою або зруйновані віріони (раздроблені на декілька крупних субодиниць) – це спліт-вакцини, або поверхневі антигени вірусів – головним чином протективні антигени; · рекомбінатні вакцини – при створенні транс генних генно-інженерних вакцин в геном живих непатогенних мікроорганізмів, це можуть бути дріжджові клітини, вбудовують гени, що детермінують синтез проективних антигенів вірусу, проти якого необхідно створити імунітет, і ці мікроорганізми починають синтезувати відповідні антигени. Далі мікроорганізми руйнують, а антигени очищують та консервують. Такою вакциною є рекомбінантна вакцина дріжджова вакцина HBs-Аг гепатиту В. Для серотерапії та серопрофілактики вірусних інфекцій можуть бути використані препарати крові: сироватки та гама-глобуліни
Гомологічні сироваткові препарати	Отримують з сироватки реконвалісцентів або вакцинованих людей, наприклад препарати направленої дії – протигрипозний, антирабічний імуноглобуліни та інші. Гомогенні сироваткові препарати не є чужорідними для організму людини, не реактогенні
Гетерогенні сироваткові препарати	(як правило з крові гіперімунізованих коней) є чужорідними для організму людини, вони мають ряд недоліків: - викликають сенсибілізацію організму з розвитком реакцій ГНТ (анафілактичний шок, сироваткова хвороба); - мають короткочасну дію (10 – 15 діб)

Додаток Б (обов‘язковий )

Граф логічної структури теми:

„Структура, класифікація та особливості життєдіяльності вірусів. Методи лабораторної діагностики вірусних інфекцій та їх особливості. Особливості противірусного імунітету”.