Белки - ингибиторы ферментов

 

Они ингибируют действие протеолитических ферментов (протеиназ). В настоящее время хорошо изу­чены: a₁-анти­три­п­син, a₂-макроглобулин, ин­тер-a -трипсиновый ингибитор. Они ингибируют многие фер­менты сверты­ва­ния крови, а также трипсин и химотрипсин. Считают, что a₁- антитрипсин может играть защитную роль, ингибируя протеиназы, поступающие в кровь в результате лизиса клеток; он также по­давляет подвижность сперматозоидов в половых путях, эластазу нейтрофилов. Недостаток этого ингиби­тора приво­дит к развитию воспаления в зоне очага.

 

Белки острой фазы

Это группа белков плазмы, содержание которых увеличивается в ответ на повреждение ткани, воспале­ние, опухо­левый процесс. Эти белки синтезиру­ются в печени и являются гликопротеинами. К белкам ост­рой фазы отно­сятся:

– гаптоглобин ( увеличивается в 2-3 раза, особенно при раке, ожо­гах, хирургических вмеша­тельствах, воспалении);

– церулоплазмин (имеет значение как антиоксидант);

– трансферрин (содержание снижается);

– С-реактивный белок. Отсутствует в сыворотке здорового человека, но обнаруживается при патологи­ческих состояниях, сопровождающихся некро­зом (острая фаза ревматизма, инфаркт миокарда и др.). Предполагается, что он способствует фагоцитозу.

– интерферон - специфический белок, появляющийся в клетках в резуль­тате проникновения в них ви­русов. Он угнетает размножение вирусов в клет­ках. Обладает видовой специфичностью, но не абсолют­ной.

– фибриноген, основная функция которого участие в свертывании крови. Синтез фибриногена начина­ется через несколько часов после травмы с мак­симумом на конец 1-2 суток.

Раздел 3. Лабораторно-практические занятия

Занятие №1

1.Тема: Обмен нуклеотидов и нуклеиновых кислот.

2. Форма учебного процесса: Лабораторно-практическое занятие.

3. Актуальность: Нуклеиновые кислоты составляют существенную небелковую часть нуклеопротеидов. Помимо важной роли нуклеиновых кислот в хранении и реализации наследственной информации, промежуточные продукты их обмена – нуклеотиды, выполняют ругуляторные функции, контролируя биоэнергетику и скорость метаболических процессов. Знание процессов обмена азотистых оснований необходимо для изучения патологии пуринового обмена. Материал данной темы используется в курсах терапии, урологии и гематологии.

4. Цель общая:

4.1.1. Изучить синтез и распад пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов.

4.1.2. Научиться определять содержание мочевой кислоты в сыворотке крови и моче.

4.2. Конкретные цели:

 

Знать:

1. Строение и функции нуклеотидов и нуклеиновых кислот.

2. Обмен нуклеиновых кислот и нуклеотидов.

 

Уметь:

1. Определять мочевую кислоту в сыворотке крови.

2. Объяснять полученные результаты.

 

Вопросы для самостоятельной подготовки к занятию

Исходный уровень знаний

1. Строение пуриновых и пиримидиновых азотистых оснований.

2. Строение нуклеозидов и нуклеотидов.

3. Функции нуклеотидов.

4. Строение нуклеиновых кислот.

5. Отличия ДНК и РНК.

6. Понятие о нуклеопротеидах. Примеры нуклеопротеидов.

 

По новой теме

 

 

1. Виды нуклеиновых кислот, строение и функции.

2. Переваривание нуклеопротеидов.

3. Распад пуриновых оснований. Подагра.

4. Распад пиримидиновых оснований.

5. Синтез пиримидиновых нуклеотидов.

6. Синтез пуриновых нуклеотидов. Болезнь Леша-Нихана.

 

Учебно-исследовательская работа студентов на занятии

 

 

1. Проделать лабораторную работу "Определение мочевой кислоты".

2. Сделать выводы по результатам проведенных опытов. Оформить результаты опытов в виде таблицы и графика.

3. Подготовиться к защите лабораторной работы и решению задач (ориентировочные задачи и вопросы приведены ниже).

 

 

Лабораторная работа

 

1. Определение мочевой кислоты в сыворотке крови

Оборудование:	1.	Штатив с пробирками.
	2.	Пипетки на 1 мл и 2 мл.
	3.	КФК.
	4.	Кюветы на 0,5 см.
	5.	Центрифуга.
Реактивы:	1.	20% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ).
	2.	Насыщенный раствор соды.
	3.	Реактив Фолина (фосфорно-вольфрамовый реактив).
	4.	Дистиллированная вода.
	5.	Сыворотка крови.
	6.	Разведенная в 50 раз моча.

Принцип метода. Мочевая кислота восстанавливает фосфорно-вольфрамовый реактив с получением окрашенных продуктов синего цвета. Интенсивность окраски определяют колориметрически.

 

Ход работы. В центрифужную пробирку наливают 1 мл сыворотки, 1 мл дистиллированной воды и 1 мл 20% раствора ТХУ. Перемешивают и через 15 мин центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин. В чистую пробирку наливают 1,5 мл прозрачного центрифугата, 0,7 мл насыщенного раствора соды и 1 каплю реактива Фолина (фосфорно-вольфрамовый реактив). Через 10 мин пробу колориметрируют при зеленом светофильтре в кювете толщиной 0,5 см против воды.

Концентрацию мочевой кислоты определяют по калибровочному графику.

 

 

2. Определение мочевой кислоты в моче

Проводится так же, как в сыворотке, только вместо центрифугата сыворотки в пробу добавляют 1,5 мл мочи, разведенной в 50 раз. Содержание мочевой кислоты в пробе определяют по калибровочному графику и используют для расчета количества мочевой кислоты, выделяемого с мочой за сутки.

Расчет проводят по формуле: А х 0,075 = г/сутки, где

А – количество мкг мочевой кислоты, определенной по графику;

0,075 – коэффициент пересчета, переводящий мкг мочевой кислоты в г с учетом количества суточной мочи.

Нормальное содержание мочевой кислоты в сыворотке крови – 0,12-0,46 ммоль/л. С мочой за сутки выводится 0,4-1 г мочевой кислоты.

 

Диагностическое значение определения мочевой кислоты

 

Повышение содержания мочевой кислоты в крови наблюдается при нарушении ее выделения из организма (заболевания почек, ацидоз, токсикоз беременности) и повышенном распаде нуклеопротеидов (некоторые гематологические заболевания, прием пищи, богатой пуринами).

Понижение мочевой кислоты в крови наблюдается при гепатолентикулярной дегенерации, в некоторых случаях акромегалии, у больных анемией после приема пиперазина, атофана, салицилатов, дикумерола и АКТГ.

В моче содержание мочевой кислоты возрастает при лейкемии, истинной полицитемии, терапии кортизолом или АКТГ, а также при гепатолентикулярной дегенерации.

 

Проверка качества усвоения знаний (конечный уровень)

а) Вопросы для защиты лабораторной работы

1. На чем основан метод определения мочевой кислоты?

2. При каких заболеваниях повышается концентрация мочевой кислоты в сыворотке крови и усиливается ее выделение с мочой?

3. Когда наблюдается понижение мочевой кислоты в крови?

4.Оцените результаты, полученные при проведении лабораторной работы.

5. Какие лекарственные препараты вызывают снижение мочевой кислоты в сыворотке крови?

6. Как пользоваться калибровочным графиком?

7. Каково содержание мочевой кислоты в сыворотке крови и моче здорового человека?

8. Назовите азотистые основания, катаболизм которых приводит к образованию мочевой кислоты?

 

б) ситуационные задачи

1. Составьте диету для больного подагрой.

2. У больного в крови содержится мочевая кислота в концентрации 1 ммоль/л; содержание креатинина в сыворотке крови 130 мкмоль/л. Какое заболевание можно предположить?

3. Какое наследственное заболевание сопровождается гиперурикемией?

4. Почему при лечении подагры аллопуринолом, наблюдаются ксантиновые камни?

5. Почему при лейкозах, злокачественных новообразованиях, голодании увеличивается содержание мочевой кислоты в крови и моче?

6. Почему подагру назвали "болезнью гурманов"?

7. Больному подагрой долгое время вводили аллопуринол. В результате в моче обнаружено большое содержание оротовой кислоты. Объясните это явление.

8. У двух мужчин определяли содержание мочевой кислоты в крови и моче. У одного из них концентрация мочевой кислоты в крови была 80 мг/л, а за сутки выделилось 3 г. У другого кровь содержала 20 мг/л мочевой кислоты, а за сутки выделилось 2 г. Какие выводы можно сделать по этим результатам?

 

Рекомендуемая литература

1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф., "Биологическая химия", 1998, стр. 439 –447, 469-506.

2. Строев Е.А., "Биологическая химия", 1986, стр. 292-297, 297-300.

3. Николаев А.Я., "Биологическая химия", 1989, стр. 339-350, 415-418, 437-439.

4. Лекции.

 

Занятие №2

1. Тема: "Обмен нуклеиновых кислот. Синтез белка и его регуляция"

2. Форма учебного процесса: Конференция.

3. Актуальность: Нарушение синтеза белка приводит к возникновению наследственных болезней. Знание регуляции биосинтеза белка в организме и механизмов воздействия на него лекарственных средств имеет большое значение во врачебной деятельности.

4. Цель общая:

4.1.1. Изучить синтез ДНК и РНК.

4.1.2. Изучить механизмы синтеза белка и его регуляции.

4.2. Конкретные цели:

 

Знать:

1. Репликация нуклеиновых кислот.

2. Транскрипция нуклеиновых кислот.

3. Синтез белка и его регуляция.

 

Вопросы для самостоятельной подготовки к занятию

 

Исходный уровень

1. Строение нуклеотидов.

2. Строение нуклеиновых кислот.

3. Ферменты.

4. Строение белков.

 

По новой теме

 

1. Репликация.

2. Транскрипция.

3. Генетический код. Свойства.

4. Рекогниция.

5. Трансляция.

6. Регуляция биосинтеза белка.

 

План занятия

 

1. Преподаватель предлагает провести занятие в форме конференции. Для этого группу делят на подгруппы.

2. В каждой подгруппе назначают лектора, рецензента и оппонентов.

3. Лекторы получают темы докладов. Доклад готовится в течение 20 минут. За это время остальные студенты каждой подгруппы готовят вопросы и ситуационные задачи по теме доклада.

4. Заслушивают и обсуждают все доклады.

5. В конце занятия преподаватель оценивает работу каждого студента.

 

Занятие № 3

 

1. Тема: "Азотистые вещества крови. Хромопротеиды. Взаимосвязь обменов"

2. Форма учебного процесса: Лабораторно-практическое занятие.

3. Актуальность: Материал данной темы имеет медицинское значение, в частности определение остаточного азота и билирубина используется для диагностики.

4. Цель общая:

4.1.1. Изучить белковые и небелковые азотсодержащие вещества крови.

4.1.2. Изучить строение гемоглобина, его функции, синтез и распад.

4.1.3. Изучить взаимосвязь обменов.

4.1.4. Научиться определять остаточный азот и билирубин в сыворотке крови.

4.2. Конкретные цели:

 

Знать:

1. Функции белков плазмы крови.

2. Небелковые азотсодержащие вещества крови.

3. Виды гиперазотемий.

4. Обмен билирубина, клиническое значение.

5. Взаимосвязь обменов.

 

Уметь:

 

1. Определять остаточный азот в сыворотке крови.

2. Определять билирубин и его фракции в сыворотке крови.

3. Объяснять полученные результаты.

 

Вопросы для самостоятельной подготовки к занятию

 

Исходный уровень

 

1. Строение и свойства простых и сложных белков.

2. Этапы катаболизма веществ.

3. Гликолиз, окисление жирных кислот и глицерина, цикл Кребса, пентозофосфатный путь.

 

По новой теме

 

 

1. Белки плазмы крови, функции, изменения содержания.

2. Остаточный азот крови и его фракции.

3. Гиперазотемии.

4. Хромопротеиды. Классификация. Роль хромопротеидов.

5. Гемоглобин, строение, значение.

6. Синтез и распад гемоглобина.

7. Формы билирубина и их значение для диагностики.

8. Связь углеводного и липидного обменов.

9. Связь липидного и азотистого обменов.

10. Связь углеводного и азотистого обменов.

11. Связь обмена нуклеиновых кислот с другими обменами.

 

 

Учебно-исследовательская работа студентов на занятии

 

1. Проделать лабораторную работу "Определение остаточного азота и билирубина в сыворотке крови".

2. Сделать выводы по результатам проведенных опытов. Оформить результаты опытов.

3. Подготовиться к защите лабораторной работы и решению задач (ориентировочные задачи и вопросы приведены ниже).

 

Лабораторная работа

 

I. Определение остаточного азота в сыворотке крови.

 

Оборудование:	1.	Штатив с пробирками.
	2.	Пипетки на 0,1мл,1 мл и 5 мл.
	3.	Колба на 50 или 100 мл.
	4.	Центрифуга.
	5.	Центрифужные пробирки.
Реактивы:	1.	Реактив А.
	2.	Реактив В.
	3.	КI кристаллический.
	4.	НСl
	5.	1% раствор крахмала
	6.	Сыворотка.
	7.	Дистиллированная вода.
	8.	0,005 Н раствор тиосульфата натрия.

Принцип метода. Остаточный азот – это небелковый азот биологических жидкостей. Гипобромитный метод его определения основан на свойстве гипобромита разрушаться при взаимодействие с азотистыми веществами безбелкового центрифугата. Остаток непрореагировавшего гипобромита определяют йодометрически – титрованием тиосульфатом натрия. Для расчета количества остаточного азота определяют количество разрушенного гипобромита, как разность между титром контрольной пробы (не содержащей остаточного азота) и опытной пробы (с остаточным азотом).

 

Ход работы. Для осаждения белков в пробирку наливают 1 мл дистиллированной воды, 0,1 мл сыворотки и 4,0 мл осаждающего реактива. Через 10 мин смесь центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин. За это время готовят рабочий раствор гипобромита, смешивая 9 частей реактива А и 1 часть реактива В. В колбу для титрования отбирают 4 мл центрифугата, добавляют 5 мл рабочего раствора гипобромита, перемешивают и оставляют на 1-2 мин. Затем добавляют несколько кристалликов КI, 3 мл раствора НСl, смесь взбалтывают и титруют 0,005Н раствором тиосульфата до слабо-желтого цвета. Добавляют 2-3 капли раствора крахмала и дотитровывают до обесцвечивания. Одновременно с опытной готовят контрольную пробу, содержащую 4 мл осаждающего реактива, 5 мл рабочего раствора гипобромита, несколько кристалликов KI и 3 мл раствора HCI. Контрольную пробу титруют также до обесцвечивания.

Содержание остаточного азота рассчитывают по формуле:

(К - О) х 21,4 = ммоль/л, где К – количество тиосульфата, пошедшего на титрование контрольной пробы, О – на титрование опытной пробы, 21,4- коэффициент пересчета.

Нормальное содержание остаточного азота – 14,3 - 28,6 ммоль/л.

 

 

Диагностическое значение определения остаточного азота

Ретенционная (связанная с выведением) почечная гиперазотемия наблюдается при различных заболеваниях почек. Ретенционная непочечная гиперазотемия наблюдается при недостаточности кровообращения, травматическом шоке, опухолях мочевого пузыря.

Продукционная гиперазотемия сопровождается процессом усиления распада белка - при туберкулезе, диабете, тяжелом циррозе печени, при инфекционных заболеваниях, сопровождающихся лихорадкой. Понижение остаточного азота наблюдается при недостаточном питании, иногда – при беременности.

 

 

2. Определение билирубина в сыворотке крови.

Оборудование:	1.	Штатив с пробирками.
	2.	Пипетки на 1 мл и 2 мл.
	3.	КФК.
	4.	Кюветы на 0,5 см.
	Реактивы:	1.	Кофеиновый реактив.
		2.	0,85% раствор NaCl.
		3.	Диазореактив.
		4.	Сыворотка крови.

Принцип метода. Связанный билирубин при взаимодействии с диазореактивом (диазофенилсульфоновая кислота) образует розовое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна концентрации билирубина, вступающего в прямую реакцию. Кофеиновый реактив переводит свободный билирубин в растворимое состояние, благодаря чему он также реагирует с диазореактивом, образуя розовое окрашивание. По интенсивности этого суммарного окрашивания определяют концентрацию общего билирубина. А концентрацию свободного билирубина определяют как разность между общим и связанным билирубином.

 

Ход работы. В 3 пробирки приливают реактивы по схеме:

 

Реактивы (мл)	Общий билирубин	Связанный билирубин	Контрольная проба
Сыворотка	0,5	0,5	0,5
Кофеиновый реактив	1,75	----	1,75
0,85% раствор NaCl	----	1,75	0,25
Диазореактив	0,25	0,25	----

 

Через 5-10 мин после прибавления диазореактива колориметрируют пробу на связанный билирубин (при более длительном стоянии пробы в реакцию вступает несвязанный билирубин, что искажает результат). Пробу на общий билирубин колориметрируют через 20 мин после добавления диазореактива. Колориметрирование проводят при зеленом светофильтре в кювете толщиной 0,5 см против контроля. Концентрацию общего и связанного билирубина определяют по калибровочному графику.

Нормальное содержание билирубина в сыворотке: общий – 1,7-20,5 мкмоль/л, связанный – 0,86-4,3 мкмоль/л, свободный – 1,7-17,1 мкмоль/л.

 

Диагностическое значение определения билирубина сыворотки крови

Причины, вызывающие гипербилирубинемию, различны. Желтуха появляется, когда уровень билирубина в крови превышает 43 мкмоль/л. Заболевания, вызывающие повышение связанного билирубина: вирусный гепатит, цирроз печени, опухоль печени и метастазы, жировая дистрофия.

Заболевания, вызывающие повышение несвязанного билирубина: гемолитическая анемия, пернециозная анемия, желтуха новорожденных.