Клональне мікророзмноження лісових рослин та його переваги перед традиційними способами вегетативного розмноження

Одним з найперспективніших шляхів розмноження і отримання високоякісного садивного матеріалу є метод культури ізольованих тканин і органів – вирощування нових рослин з певних груп клітин, генотип яких повністю визначається сортовими особливостями материнської особини. Таке вегетативне розмноження рослин називають клональним мікророзмноженням.

Цей метож має ряд переваг над традиційними способами вегетативного розмноження, оскльки вн дає можливість: а)отримувати рослини вегетативного походження, які дуже важко, або зовсім не розмножуються іншими традиційними методами вегетативного розмноження; б) розмножувати та отримувати садивний матеріал упродовж всього року; в) прискорювати хід селекційних процесів за рахунок генної інженерї; г) використовувати для вегетативного розмноження практично усі тканини та органи материнських рослин; дотримувати нові рослини вільні від патогенів і вірусних інфекцій.

73. Етапи клонального мікророзмноження

Технологія мікроклонального розмноження рослин складається з таких основних етапів:

o Підбір експлантів і введення їх в культуру.

o Активація розвитку пагонів з експланту при підвищеній концентрації цитокінінів живильного середовища.

o Укорінення пагонів при збільшенній концентрації ауксинів в поживному середовищі.

o Переведення одержаних рослин із стерильних умов у ґрунт, їх адаптація (перенесення з умов in vitro в умови in vivo).

Найбільш важливим моментом є вибір материнської рослини і експланту. Термін «експлант» застосовують для назви вихідного шматочка рослини, який вводять в культуру in vitro.

В якості експлантів використовують:

- верхівки пагонів,

- бокові бруньки,

-частинки кореня або листка,

-черешок листка, суцвіття,

-пелюстки квітів,

-гіпокотиль проростаючого насіння та інші частини рослин.

Для успішного проведення робіт з регенерації рослин вибір експлантів відіграє першочергове значення. Краще всього використовувати матеріал вилучений з здорових, сильних рослин. Вибір експланта залежить від виду, стану рослини-донора, фази її розвитку, сезону року. Значення має навіть положення експланта на рослині. Так, верхівки пагонів, взяті з верхніх гілок дерева, мають більшу швидкість розмноження, ніж верхівки з нижніх гілок. Більшість експлантів добре вводяться в культуру у фазу активного росту донорської рослини. Проте є рослини, експланти з яких утворюють пагони лише в стані спокою. Незрілі, молоді органи завжди більш пластичні з точки зору здатності до морфогенезу in vitro, ніж старіючі, зрілі тканини та органи. Більше того, при виборі експлантів слід віддавати перевагу меристематичним тканинам, оскільки вони легше виживають у культурі, мають більшу швидкість росту і тотипотентність. Розмір експланта теж визначає ступінь виживання in vitro (крупніші за розміром верхівки пагона завжди краще виживають).

Донорські рослини, з яких збираються вилучити експланти, вирощують у якомога чистому середовищі, уникаючи надмірного поливання, забруднення пагонів і листків. Важливими компонентами успіху є очистка і стерилізація рослинного матеріалу передвведенням його в культуру in vitro.

На другому етапі при підвищеній концентрації цитокінінів поживного середовища, долається ефект апікального домінування в умовах in vitro і утворюється цілий пучок пагонів першого, другого, третього і т.д. порядку. Цей процес називається проліферацією пагонів in vitro.

Утворені пагони знову пересаджуються на те саме поживне середовище для подальшого одержання нових пагонів з його пазухових бруньок. Подібний процес можна продовжувати і одержувати величезні кількості пагонів за відносно короткий період часу.

Метод проліферації пазухових пагонів з апексів або бруньок є найбільш поширеним у практиці мікроклонального розмноження різних видів рослин. При утворені пагонів, поживне середовище повинно містити цитокінінів більше ніж ауксинів. Це «золоте правило пагоноутворення»має винятки для деяких видів рослин.

В культурі in vitro використовують такі цитокініни: кінетин, зеатин, БАП;

ауксини: ІОК, ІМК, НОК, 2,4-Д.

Співвідношення цитокінін/ауксин підбирається експериментально.

Важливе значення для активації формування пагонів мають умови освітлення і температури. Світло необхідне для морфогенезу і утворення хлорофілу. Використовують, як правило, люмінесцентні лампи з інтенсивністю світла 1000-1500 люкс. Оптимальним періодом освітленості для більшості рослин вважають проміжок часу 16 годин, температура 20-25 ºС.

Існує метод одержання пагонів з калусної тканини, який теж відноситься до мікроклонального розмноження, але мало застосовується, тому що може приводити до генетичних змін у новостворених рослин-регенерантів.

Після того, як утворилось багато пагонів, їх необхідно укорінити і одержати повноцінні рослини. Основні індуктори коренеутворення (ризогенезу) – ауксини. Для формування коренів пагони відділяють і висаджують на поживне середовище, яке містить ауксинів більше, ніж цитокінінів. Це основне правило коренеутворення in vitro, яке має свої винятки. Під впливом ауксинів стимулюється поділ клітин паренхіми пагона, що приводить до диференціації кореневих зачатків в його базальній частині. Утворення адвентивних коренів може також спонтанно проходити при перенесенні пагонів на середовище без цитокінінів (особливо у однодольних рослин).

Ріст пагонів і їх подальше укорінення приводить до утворення невеличких рослин з 5-6 листочками. Стебло можна розрізати на 5-6 мікроживців, які у сприятливих умовах виростають до нормальних рослин. Процес дозволяє безперервно одержувати великі кількості рослин.

Укоріненість пагонів in vitro залежить від кількості їх субкультивувань до укорінення: із збільшенням кількості пасажів укоріненість зростає і скорочуються строки появи коренів на пагонах.

Технологія мікроклонального розмноження рослин складається з основних етапів:

- Вибір рослини донора

- Вибір експлантів їх стерилізація та введення в культуру.

- Активація розвитку пагонів із експлантів при підвищенім рівні концентрації цитокінінів.

- Укорінення пагонів при збільшенні концентрації ауксинів.

- Переведення отриманих клонів з умов invitro в умови invivo.

Одним з найважливіших етапів в цьому процесі є вибір материнської особи та експланту.

74. Опишіть особливості відбору експлантів в мікроклональному розмноженні рослин.

Термін «експлант» застосовують для назви вихідного шматочка рослини, який вводять в культуру in vitro.

В якості експлантів використовують:

- верхівки пагонів,

- бокові бруньки,

-частинки кореня або листка,

-черешок листка, суцвіття,

-пелюстки квітів,

-гіпокотиль проростаючого насіння та інші частини рослин.

Для успішного проведення робіт з регенерації рослин вибір експлантів відіграє першочергове значення. Краще всього використовувати матеріал вилучений з здорових, сильних рослин. Вибір експланта залежить від виду, стану рослини-донора, фази її розвитку, сезону року. Значення має навіть положення експланта на рослині. Так, верхівки пагонів, взяті з верхніх гілок дерева, мають більшу швидкість розмноження, ніж верхівки з нижніх гілок. Більшість експлантів добре вводяться в культуру уфазу активного росту донорської рослини. Проте є рослини, експланти з яких утворюють пагони лише в стані спокою. Незрілі, молоді органи завжди більш пластичні з точки зору здатності до морфогенезу in vitro, ніж старіючі, зрілі тканини та органи. Більше того, при виборі експлантів слід віддавати перевагу меристематичним тканинам, оскільки вони легше виживають у культурі, мають більшу швидкість росту і тотипотентність. Розмір експланта теж визначає ступінь виживання in vitro (крупніші за розміром верхівки пагона завжди краще виживають).

Донорські рослини, з яких збираються вилучити експланти, вирощують у якомога чистому середовищі, уникаючи надмірного поливання, забруднення пагонів і листків. Важливими компонентами успіху є очистка і стерилізація рослинного матеріалу перед введенням його в культуру in vitro.

Таким чином, відібраний і простерилізований експлант вводиться в культуру на спеціальне поживне середовище.

75. Опишіть процес адаптації клонів у грунтових умовах в мікроклональному розмноженні рослин. Мікроклональне розмноження - це безстатеве вегетативне розмноження в культурі in vitro, при якому отримують рослини генетично ідентичні вихідній батьківській формі, що сприяє збереженню генетично однорідного посадкового матеріалу. Цим методом можна розмножувати у короткі строки види, які важко розмножуються і рослини, які є в одному екземплярі, а також і стерильні генотипи. Особливої актуальності сьогодні набули дослідження по розробці методів мікроклонального розмноження рідкісних та зникаючих рослин. Багаточисельність, швидкість і високий коефіцієнт розмноження (1:1 000 000) дозволяє у 2–3 рази скоротити термін відбору і отримання нових рослин у селекційних дослідженнях.

КЛОН-сукупність генетично однорідних клітин, які походять від однієї клітини. Клон — основна одиниця обліку у генетиці мікроорганізмів. В основі утворення клонів лежить мітоз, або прямий поділ, наприклад, у бактерій, внаслідок чого генетична інформація розподіляється порівну між дочірніми клітинами. Тривалість життя клонів обмежена, тому що серед споріднених клітин можуть виникати мутантні і давати початок новим клонам.

Мікроклональне розмноження має цілий ряд переваг над традиційними методами розмноження рослин:

1) економія вихідного матеріалу;

2) отримання великого числа копій із мінімальної кількості рослинного матеріалу;

3) отримання генетично однорідного матеріалу;

4) можливість відбирати in vitro рослинний матеріал з бажаними ознаками;

5) можливість отримання безвірусного матеріалу;

6) можливість проводити розмноження рослин протягом цілого року, адже їх ріст і розвиток in vitro практично не залежать від сезону;

7) можливість отримувати у великих кількостях вегетативне потомство видів рослин, що важко розмножуються у звичайних умовах;

8) економія площі;

9) можливість тривалого збереження пробірочних рослин при понижених температурах, що дає змогу створити банк цінних форм рослин.