Механизмы создания колонизационной резистентности, ее контроль

1. Способность ряда представителей нормальной микрофлоры к адгезии на эпителии слизистой оболочки. Образуемый бактериями пристеночный слой (биопленка) препятствует прикреплению к эпителиальным клеткам кишечника патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Для создания пол­ноценной защиты от возникновения инфекции необходимо присутствие большого числа разнообразных представителей нормофлоры.

2. Синтез индигенными микроорганизмами ряда веществ, подавляющих рост и размножение патогенов (молочная, муравьиная, уксусная, пропионовая кислоты, летучие жирные кислоты, перекись водорода и другие биологически активные субстанции).

3. Конкуренция с патогенными микроорга­низмами за источники питания, в которой преимущество – на стороне нормальной микрофлоры.

2. Качественный и количественный состав микрофлоры различных областей тела человека

Состав микрофлоры и размножение ее представителей контро­лируется, прежде всего, макроорганизмом с помощью различных факторов и механизмов.

- Механические факторы: десквамация эпителия кожи и слизистых оболочек, удаление микробов секретами (кашель, чихание и пр.), перистальтикой кишечника, гидродинамической силой мочи в мочевом пузыре и т.п.

- Химические факторы: соляная кислота желудочного сока, щелоч­ные секреты, желчные кислоты в тонком кишечнике, кишечный сок толстого кишечника.

- Бактерицидные секреты слизистых оболочек и кожи.

- Иммунологические механизмы: подавление адгезии бактерий на слизистых оболочках секреторными антителами класса IgA.

Различные области тела человека (биотопы) имеют характерную микрофлору, отличающуюся по своему качественному и количествен­ному составу, что зависит от их анатомо-физиологических особеннос­тей. В течение жизни микрофлора отдельного биотопа претерпевает изменения, связанные с полом, возрастом и общим состоянием орга­низма.

Микрофлора кожи. Нормальная микрофлора кожи локализована преимущественно в толще эпидермиса, в волосяных фолликулах и в наибольшем количестве – в сальных железах. На поверхности кожи преобладает транзиторная флора, которая частично погибает благодаря бактерицидным свойствам кожи и легко удаляется при слущивании отжившего эпителия и водных процедурах. Микрофлора различных биотопов имеет отличия.

Основные индигенные представители микрофлоры – палочки грамположительные и грамотрицательные, не образующие спор, как аэробные, так и анаэробные (роды Corynebacterium, Brevibacterium, Propionibacterium), спорообразующие аэробные палочки (род Bacillus), грамположительные кокки (стафилококки, прежде всего эпидермаль­ные, и микрококки).

Аэробные коринеформные бактерии рода Corynebacterium об­наруживаются в кожных складках – в подмышечных впадинах и про­межности, где имеется повышенная влажность. Представители рода Brevibacterium (2-й род аэробных коринеформных бактерий) чаще всего встречаются на стопах ног.

Излюбленной локализацией Staphylococcus epidermidis и Staphylococcus capitis является волосистая часть головы.

Анаэробные пропионибактерии преобладают на крыльях носа и других участках лица, на коже спины (в сальных железах). На фоне гормональной перестройки Propionibacterium aсnes играют значитель­ную роль в возникновении юношеских acne vulgaris.

Микрофлора дыхательных путей. Нормальная микрофлора дыхательного тракта сосредоточена в носоглотке. Гортань (ниже над­гортанника), трахея, бронхи и легочные альвеолы здорового человека, как правило, стерильны.

В носовых ходах индигенная микрофлора представлена коринебакте­риями, постоянно присутствуют резидентные S.epidermidis и микро­кокки, встречаются непатогенные нейссерии, гемофильные палочки, среди анаэробов – бактероиды, вейллонеллы, анаэробные кокки. На миндалинах преобладают зеленящие стрептококки и анаэробные кокки, которые могут вызывать тонзиллиты.

Транзиторная флора постоянно попадает в носоглотку при дыха­нии, а также из ротоглотки, и в значительной степени удаляется реснич­ками эпителия, смывается слизью, элиминируется секреторными IgA, лизоцимом. Препятствует колонизации посторонними микроорганиз­мами, в том числе и патогенными, покрывающая слизистые оболочки носоглотки защитная биопленка.

Микрофлора мочеполовой системы. Мочевыводящая система, в том числе и мочевой пузырь, в норме не содержат микробов, за исключением передней уретры, где встречаются стафилококки, непа­тогенные нейссерии, коринебактерии, микоплазмы, кандиды и другие микроорганизмы.

На коже и слизистых наружных половых органов обитают аэробы и анаэробы: эпидермальные стафилококки, зеленящие стрептококки, коринебактерии, микобактерии (Mycobacterium smegmatis), энтеробак­терии, бифидобактерии, фузобактерии, анаэробные кокки.

Влагалище. Большое значение имеет микрофлора влагалища, которая защищает репродуктивные органы женщины в детородном периоде от проникновения посторонней микрофлоры (полость матки здоровых женщин стерильна). Кроме того, состояние микрофлоры влагалища женщины-матери влияет на состав микрофлоры ее ново­рожденного ребенка.

В разные периоды жизни микрофлора влагалища имеет сущес­твенные отличия. У девочек она малочисленна и имеет сходство с микрофлорой кожи, секрет влагалища нейтрален (значение рН 7,0).

С наступлением половой зрелости происходит резкое изменение количественного и качественного состава микрофлоры. Под влиянием гормонов – эстрогенов в эпителии влагалища в большом количестве накапливается гликоген, благодаря чему создаются оптимальные ус­ловия для лактобактерий и некоторых других микробов. Обладая саха­ролитическими свойствами, лактобактерии метаболизируют гликоген, образуют молочную и другие кислоты, получая при этом необходимую энергию. Секрет влагалища приобретает кислое значение (рН 4 - 5), что также благоприятствует жизнедеятельности лактобактерий, их ко­личество достигает 10⁸ КОЕ/мл. Кроме доминирующих лактобактерий, во влагалище преобладают анаэробы - бактероиды, бифидобактерии, пептококки; аэробы представлены стафилококками, коринебактерия­ми, однако их количество не превышает 103 - 104КОЕ/мл. У некоторых женщин встречаются стрептококки, гарднереллы, микоплазмы, хла­мидии, кандиды.

Наибольшее значение имеют лактобактерии – палочки Додерлейна (L.acidophylus). Они играют основную роль в колонизации слизистой оболочки влагалища и образовании биопленки, обладают выраженными антимикробными свойствами благодаря образованию молочной кис­лоты, перекиси водорода, продукции антибиотикоподобных веществ. Все эти факторы препятствуют колонизации влагалища посторонними микроорганизмами, и в том числе патогенными.

3. Микрофлора пищеварительного тракта

В пищеварительном тракте сосредоточена основная часть нор­мальной микрофлоры организма человека. Причем, различные отделы пищеварительной системы значительно отличаются по качественному и количественному составу присутствующих микроорганизмов.

Полость рта (ротоглотка). В ротовой полости содержатся более 300 видов микроорганизмов (индигенных и транзиторных). Общее количество микробов в слюне может достигать 10⁸-10⁹ КОЕ/мл. Интен­сивному размножению микроорганизмов в полости рта способствуют оптимальные температура и влажность, щелочная реакция слюны, наличие необходимых питательных веществ. Количество анаэробных бактерий в 10 раз превышает количество аэробов.

Характерные анаэробные грамположительные бактерии представлены родами Eubacterium, Lactobacterium, Bifidobacterium, Peptostreptococcus, Propionibacterium и другими. Среди анаэробных грамотрицательных бактерий преобладают Bacteroides и Fusobacterium, реже встречаются Leptotrichia, Veillonella и другие.

Наиболее многочисленными представителями аэробной микро­флоры являются Micrococcus spp., Streptococcus spp., а также стафи­лококки. Кроме того, в ротовой полости встречаются микоплазмы, спиро­хеты, грибы и простейшие.

Желудок. Концентрация микроорганизмов в желудке резко падает и составляет не более 10³ КОЕ/мл, так как благодаря действию соляной кислоты желудочного сока большинство микроорганизмов погибает.

Выжившая микрофлора, преимущественно грамположительная, на­ходится в толще слизистого слоя и представлена микрококками, лак­тобактериями, реже встречаются вейллонеллы, бактероиды и грибы. Следует отметить, что у некоторых здоровых людей в слизистом слое желудка обнаруживается Helicobacter pylori, который может вызывать гастриты и язвенную болезнь желудка.

Тонкий кишечник. Проксимальный отдел тонкого кишечника содержит небольшое количество микроорганизмов – примерно 10³-10⁵ КОЕ/г. Чаще всего встречаются лактобактерии и стрептококки. Мало­численность микрофлоры обусловлена, по-видимому, рядом причин: низкими значениями рН желудка, антибактериальными свойствами желчи и кишечного сока, а также характером нормальной двигательной активности кишечника.

В дистальном отделе тонкого кишечника уровень микроорганиз­мов повышается до 10⁷-10⁸ КОЕ/г, а их качественный состав прибли­жается к составу микрофлоры толстого кишечника.

Толстый кишечник. В толстом кишечнике, особенно в его дис­тальном отделе, находится огромное количество микроорганизмов, общая масса которых составляет 1,5-3,0 кг. Микрофлора толстого кишечника содержит до 500 микробных видов, общее количество микроорганизмов достигает 10¹² КОЕ в грамме фекалий. Преобладаю­щими микроорганизмами являются облигатные анаэробы, на их долю приходится более 99% всей микрофлоры. Доля аэробов составляет менее 1%.

Для изучения микрофлоры в последнее десятилетие используются как классические бактериологические, так и молекулярно-генетические технологии. Недостатками культуральных методов являются: длительность, трудоемкость, низкая разрешающая способность метода (выявляет от 100 жизнеспособных бактериальных клеток), существование некультивируемых микроорганизмов, к которым относится большинство микроорганизмов, заселяющих кишечник.

Использование молекулярно-генетических методов коренным образом изменило наши представления о составе микрофлоры.

       Преобладающие группы бактерий в микрофлоре толстого кишечника.

1 доминирующая группа (до 43%) Clostridium coccoides group

Clostridium, Eubacterium, Ruminococcus, Coprococcus, Dorea, Lachnospira, Roseburia and Butyrivibrio

2- доминирующая группа (19-25%) Clostridium leptum

Anaerqfilum, Clostridium, Eubacterium, Ruminococcus

3- группа

Cytophaga-Flavobacter-Bacteroides

1 минорная группа Bifidobacterium (около 10%),

однако у детей раннего возраста является доминирующей группой сахаролитических бактерий

2 – минорная группа

Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc

Различают просветную (полостную) и мукозную микрофлору, практически не отличающуюся по видовому составу у здоровых людей (отличия могут появиться при возникновении патологии). Просветная микрофлора находится свободно в полости толстой кишки и численно преобладает. Мукозная микрофлора локализуется на поверхности эпителиаль­ных клеток, в глубоком слое мукозного геля крипт, в толще мукозного геля, в бактериальной биопленке. Она значительно лучше защищена от неблагоприятных воздействий, чем просветная микрофлора.

Микрофлора толстого кишечника выполняет многочисленные физиологические, биохимические и защитные функции и, бла­годаря своей колоссальной численности и разнообразному видовому составу, играет важнейшую роль в поддержании гомеостаза организма человека, следовательно, и в сохранении его здоровья.

Формирование микрофлоры толстого кишечника новорожденных и детей раннего возраста. Функции основных представителей нормальной микрофлоры толстого кишечника.

В течение внутриутробного развития человеческий плод находит­ся в стерильных условиях. Впервые ребенок встречается с микроор­ганизмами во время родов, соприкасаясь со слизистыми оболочками родовых путей матери. Микрофлора матери попадает на кожу, слизис­тые оболочки, в полость рта, а затем и в кишечник новорожденного. В процессе родов и сразу после них новорожденный ребенок контак­тирует с медицинским персоналом и микроорганизмами окружающей среды, а затем повторно с матерью во время грудного кормления.

Колонизация микроорганизмами организма новорожденного осуществляется из двух источников: родового канала и кожи матери и объектов окружающей среды. На становление микрофлоры новорожденного оказывают опреде­ленное влияние санитарное состояние помещений роддома, (количество микробов в воздухе не должно превышать 1500 КОЕ/м3) и контакты с медперсоналом.

Огромное значение для новорожденного имеет естественное вскармливание, которое во многом определяет скорость и качество формирующейся микрофлоры. В состав грудного молока входят вещес­тва (олигосахариды, лактоферрин и др.), оказывающие бифидогенный эффект, то есть стимулирующие интенсивное размножение бифи­добактерий. Кроме того, исследования грудного молока, проведенные в последние годы с применением молекулярно-генетических методов, позволили обнаружить ДНК бифидобактерий в высокой концентрации в 50 % образцов.

Преобладание бифидобактерий в составе микрофлоры детей раннего возраста повышает их устойчивость к инфекционным заболеваниям, влияет на развитие механизмов иммунного ответа. У ребенка обнаружено от 1 до 4 видов бифидобактерий. Доминирующими видами являются B. longum, B. adolescentis, B. breve, B. рseudocatenulatum. Доминантные штаммы имеют тенденцию к персистированию. Консервативность субвидового состава кишечных бифидобактерий может быть связана с отбором наименее иммуногенных для конкретного индивида штаммов бифидобактерий.

При проведении сравнительного генетического анализа штаммов бифидобактерий в парах мать- ребенок для установления их идентичности, идентичность штаммов была выявлена в 39% случаев. Эти штаммы принадлежали видам Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium adolescentis. Было показано, что материнские штаммы определяются более 6-7 месяцев.

Бифидобакте­рии образуют большое количество кислых продуктов, бактериоцинов, лизоцима, что позволяет им осуществлять антагонистическую актив­ность по отношению к патогенным микроорганизмам. Бифидобакте­рии обладают высокой способностью к синтезу аминокислот, белков, витаминов группы В. При снижении их количества может развиться комплекс белково-витаминной недостаточности.

Бифидобактерии содержат гены специальных ферментов (гликозидаз) и транспортных белков, необходимые для усвоения галактоолигосахаридов грудного молока. Они способны расти и размножаться на среде с галактоолигосахаридами грудного молока как единственным источником ферментируемого углевода.

Ферменты бифидобактерий функционируют внутриклеклеточно. Показана способность бифидобактерий к деградации муцина, вырабатываемого бокаловидными клетками кишечного эпителия

Способность к утилизации многочисленных сложных углеводов, необходима для эффективной персистенции бифидобактерий в просвете кишечника и их способности к продуктивной конкуренции с условнопатогенной флорой. Установлена способность бифидобактерий вырабатывать экзополисахарид.

Бифидобактерии способны осуществлять изомеризацию линолиевой кислоты с помощью фермента линолеат изомераза. Изомеры линолиевой кислоты обладают противоопухолевой и противовоспалительной активностью, являются иммуномодуляторами.

Бифидобактерии не вызывают воспалительный ответ в кишечных эпителиоцитах.

Лактобактерии – грамположительные неспорообразующие па­лочки, микроаэрофилы. Обладают антагонистической активностью, связанной с выработкой молочной кислоты, спирта, лизоцима, антиби­отикоподобных веществ, интерферонов и др. Лактобактериям свойственна выраженная способность адгезии на эпителиоциты кишечника, они участвуют в создании колонизационной резистентности, обладают иммуномодулирующим эффектом, способствуют выработке секретор­ных иммуноглобулинов.

Лактобациллы к концу 1-го месяца жизни обнаружены у 57% детей, находящихся на грудном вскармливании. Количественное содержание лактобактерий в большой степени зависит от вводимых кисломолочных продуктов (10⁶ – 10⁸ КОЕ/г). Резкое снижение количества лактобактерий или их элиминация вызывают сдвиг реакции среды в щелочную сторону, что нарушает ход биохимических процессов в кишечнике.

Род Lactobacterium включает более 40 видов, основные из них: L.acidophilus, L.casei, L.plantarum, L.bulgaricus, L.fermentum.

Бактероиды - многочисленная группа грамотрицательных, палочковидных анаэробных бактерий, относящихся к семействам Bacteroidасеаe, Porphyromonadaceae, (роды Barnesiella, Alistipes и др), Prevotellaсеае. До 6 месяцев выявляются с невысокой частотой, в 8 месяцев обнаруживаются у 80% детей, в 10 месяцев у 100%. Их содержание резко повышается и достигает концентрации взрослых 10⁹-10¹⁰ КОЕ/г к 6-7 месяцам.

Данные микроорганизмы стимулируют формирование иммунной системы ребенка, ускоряя созревание IgA- и IgG-секретирующих клеток, Th-1 ответ. Являются «биологическим реактором» производства энергии. Бактероиды способны отщеплять остатки фукозы от поверхности клеток хозяина используя их в качестве источника энергии или как строительный материал для синтеза различных молекул, включая богатые фукозой капсулы. Бактероиды участвуют в деконъюгации желчных кислот, облада­ют иммуногенными свойствами, высоким уровнем сахаролитической активности, способны расщеплять углеводосодержащие компоненты пищи, продуцируют большое количество энергии.

Клостридии – грамположительные спорообразующие палочки, строгие анаэробы. Участвуют в расщеплении желчных кислот, подде­рживают колонизационную резистентность. Клостридии производят бутират, являющийся нутритивным фактором для колоноцитов, стимулируют пролиферацию кишечного эпителия, улучшают регуляцию моторной активности подвздошной кишки и толстого кишечника и могут улучшать барьерную функцию слизистой кишечника.

Клостридии обнаружены у 45,7% детей в конце 1-го месяца жизни, у 80-100% к концу 1 года. При этом лецитиназопозитивные клостридии выявляются у 30-40% детей.

Эубактерии – грамположительные неспорообразующие палочки, строгие анаэробы. Принимают участие в деконъюгации желчных кис­лот.

Сегментированные филаментозные бактерии - некультивируемая группа грамположительных спорообразующих микроорганизмов, пока отнесены к клостридиям. Находятся в тесном контакте с эпителицитами тонкого кишечника (в инвагинациях мембраны). Играют ключевую роль в постнатальном созревании иммунной функции толстой кишки.

Энтеробактерии. Эшерихии выявляются у детей 1 месяца жизни в 78% случаев, после 6 месяцев у 100%. При этом типичные кишечные палочки обнаружены только у 60% детей, лактозонегативные встречались у 53% и гемолизинпродуцирующие у 46% обследованных детей. Клебсиеллы выделяются в высокой концентрации Lg 6,9 – 8,3 у 80 - 100% детей в возрасте 7-12 месяцев. К 2 годам их количество уменьшается. Цитробактеры, ацинетобактеры обнаружены у 30% клинически здоровых детей.

Коагулазонегативные стафилококки встречаются у 100% детей, коагулазопозитивные (S.aureus) у 30-60%.

Уровень энтерококков и частота выявления стабильны. Они обнаруживаются у 100% детей в концентрации lg 7,5+0,8 КОЕ/г. Грибы рода Candida обнаруживаются у 40-50% детей раннего возраста.

К концу первого года жизни, как правило, происходит снижение количества условно-патогенных бактерий и даже элиминация некото­рых из них. Но и в двухлетнем возрасте, когда состав микробиоценоза кишечника ребенка в основном соответствует микрофлоре взрослых людей, по своей физиолого-биохимической активности микрофлора кишечника ребенка еще значительно отстает от таковой у взрослого организма.

Основными механизмами, участвующими в контроле качествен­ного и количественного состава микроорганизмов, являются факторы естественной и физиологической защиты, созревание которых проис­ходит по мере взросления ребенка.

Контакты с бактериальными антигенами определяют созревание иммунной системы. Состав микрофлоры кишечника должен косвенно отражать особенности физиологического состояния как защитных, так и других систем организма в различные периоды жизни.

Методы исследования микрофлоры кишечника.

Бактериологический метод является классическим методом определе­ния качественного и количественного состава микрофлоры кишечника. Для этой цели пробу биоматериала (например, 1 г фекалий) предварительно разводят и полученные последовательные 10-кратные разведения засевают на чашки Петри с различными селективными, обогащенными и диф­ференциально-диагностическими средами, на которых выделяют и идентифицируют представителей нормальной мик­рофлоры как анаэробов, так и аэробов. Количественное содержание микроорганизмов в 1 г биоматериала определяют путем подсчета выросших на чашках колоний (из разных разведений) и полученное число умножают на соответствующее разведение. Результат выражают в КОЕ/г или lg КОЕ/г, и сравнивают с эталонной таблицей, в которой представлены количественные показатели фекальной микрофлоры различных возрастных групп.

В настоящее время разработаны и применяются различные био­химические и физико-химические экспресс-методы, позволяющие получать результат в день исследования. С помощью этих методов выявляют изменения в составе микрофлоры косвенным путем – по изменению состава соответствующих метаболитов. Например, умень­шение количества янтарной кислоты связано со снижением количества бифидобактерий, увеличение концентрации пропионовой кислоты – с избыточным размножением бактероидов.

Наиболее известными экспресс-методами являются газово-жид­костная хроматография, применяемая для определения в фекалиях летучих веществ – летучих жирных кислот и ароматических соедине­ний (фенолы, индолы) и жидкостная хроматография, позволяющая определять нелетучие соединения, такие как простые и сложные амины, фенилпропионовую кислоту, карбоновые кислоты и другие метабо­литы. Эти методы не позволяют идентифицировать содержащиеся в исследуемом материале анаэробы до вида.