Картирование генов с использованием транслокаций и делеций.

Транслокация – межхромосомная перестройка, во время которой негомологичные хромосомы обмениваются участками.

Делеция – утрата участка.

Было установлено, что 3 гена, кодирующие синтез трёх ферментов, локализованы в Х-хромосоме, но в каком месте – неизвестно. Случайно обнаружили ♀ с транслокацией длинных плеч 14 хромосомы на длинные плечи Х-хромосомы.

 

 

 

Гибридизовали клетки женщины и клетки мыши, отобрали определённые клоны:

1. Обе перестроенные хромосомы – х/14, 14/х;

2. х/14;

3. 14/х

 

клоны ферменты	х/14; 14/х	х/14	14/х
ГГРФТ	+	-	+
ФГК	+	-	+
Г-6-ФД	+	-	+

 

т.к. Х-хромосома несёт гены трёх ферментов, то с помощью эксперимента попытались выяснить локализацию генов этих ферментов на Х-хромосоме. Испытали клоны на синтез ферментов => гены всех трёх ферментов локализованы в длинном плече Х-хромосомы.

Для того, чтобы установить последовательность расположения генов в длинном плече, использовались клоны клеток с делециями длинного плеча Х-хромосомы.

 

клоны
ГГРФТ	+	+	-	-
ФГК	+	-	-	-
Г-6-ФД	+	+	+	-

 

Отобрали клоны с делециями плеча разной длины. Затем клоны испытали на синтез трёх ферментов.

 

                                                               

                                

 

Можно установить последовательность расположения генов в хромосоме, используя др. ферменты или др. делеции.

 

· Метод ДНК-зондов.

ДНК-зонд - копия целого гена или его части, помеченная флуоресцентной или радиоактивной меткой.

Наиболее часто, зонды получают методом обратной транскрипции. Для этого необходимо выделить иРНК и с помощью ревертазы (фермент обратной транскрипции) получаем копию гена (ДНК) и помечаем её меткой:

 

                                                иРНК

                                                ↓  

Обратная    →                                      ДНК

 транскриптаза

                               помечают меткой

 

Из эритроцитов была выделена иРНК, кодирующая α и β цепи гемоглобина; на базе этой РНК получены меченые зонды. Приготовили хромосомные препараты из культуры клеток человека. На одном из этапов, клетки обработаны с целью вызвать частичную денатурацию белка. В это же время было добавлено большое количество зондов. Затем фактор, вызывающий денатурацию убрали => ренатурация. Т.к. зондов много, они могут занять участки на ДНК, которым они комплементарны. На участке хромосома+зонд будет наблюдаться флуоресценция.

Если хромосомы окрашены дифференциально, то можно определить какая это хромосома и какой участок.

 

 

Структура генов.

Вопрос о природе аллелизма. Сравнивая аллели гетерозигот: ген представляет собой элементарную неделимую структуру, которая при мутациях изменяется целиком, т.е. ген является единицей мутации и рекомбинации.

 

Ступенчатый аллелизм.

В 1929 – 1930 гг. Серебровский и Дубинин исследовали серию множественных аллелей, которые контролировали наличие и отсутствие щетинок на различных полях у дрозофил. Scute – каждая линия характеризовалась отсутствием определенных щетинок, локус локализован в Х-хромосоме.

 Р: ♀ Х ♂

F1:  ;

Sc1 – отсутствие щетинок на участках А, В, С

Sc2 – отсутствие щетинок на участках В, С, D

 

Компаунд – гетерозигота по 2 мутантным аллелям.

Оказалось, что у компаундов отсутствуют щетинки на полях В и С. Проведя скрещивания с 13 различными линиями, они наблюдали одну и ту же закономерность как бы частичного восстановления признаков у компаундов.

Гипотеза: ген, как основа (базиген) состоит из частей, которые могут мутировать (трансгены). Т.е. ген дробим и мутирует не целиком, а по трансгенам, следовательно он не является единицей мутации.

 

Аллели – это разные состояния одного и того же гены, аллельными называют мутации, которые затрагивают один и тот же ген.

Как определить аллельны или не аллельны какие–либо 2 независимо возникшие мутации?

 

Функциональный критерий (Морган). Основан на том, что при скрещивании 2 мутантов, несущих изменения разных генов, возникает гибрид в F1, имеющий дикий фенотип.

 

Р: ♀  Х ♂

 

F1:  => признаки не аллельны

 

Р: ♀ а₁а₁ х ♂ а₂а₂

слепые  слепые

 

F1: a₁ a₂ – зрячие => признаки аллельны

 

Морган предложил этот критерий для не сцепленных генов. Льюис предложил цис -, транс- испытание, где анализировались сцепленные гены.

 

Р: ♀   Х ♂  → → не аллельные признаки

      N        мутант     N

Р: ♀   Х ♂  →  → признаки аллельные

 

Цис-испытание оказалось неинформативным, т.к. невозможно по результатам скрещивания отличить сцепленные аллельные признаки от неаллельных.

Транс-испытание (родитель имеет оба генотипических изменения).

Р: ♀   Х ♂ → → аллельные

    слепые                         зрячие

 

Расщепление – расхождение аллелей в потомстве гетерозигот.

Вывод Льюиса: неаллельные гены рекомбинируют, сцепление не влияет на функциональный критерий.

 

Рекомбинационный критерий (Морган). Основан на том, что аллельные гены расщепляются (могут и рекомбинировать), поэтому нужно исключить аллельную рекомбинацию.

 

Р: ♀ Аа х ♂ Аа

G: А а     А а

F1: AA, Aa, Aa, aa.

 

Для использования рекомбинационного критерия необходимо, чтобы один родитель обладал 2 генотипическими изменениями, а другой не имел ни одного.

 

               

Гены аллельны, т.к. наблюдается                   Гены не аллельны.

расщепление.

 

Рекомбинационный критерий может давать ошибку 10^-6, которая объясняется внутригенным кроссинговером.

 

Грин, Льюис, Оливер исследовали дрозофил Scute. Они проводили возвратное скрещивание компаундов.

х   →

Должны получаться только мутантные формы, но когда они исследовали выборку до 10000 и более мух, то они обнаружили, что в результате таких скрещиваний появляются потомки дикого типа. Это объясняется, если допустить возможность существования внутригенного кроссинговера.

 

Стали говорить о псевдоаллелизме, но когда обнаружили это явление у других видов, то согласились, что ген не является единицей рекомбинации.

Функциональный критерий тоже может давать ошибки, причина – комплиментация аллельных генов. Особенность межаллельной комплиментации – не все аллели, а только сочетания некоторых из них могут образовывать зиготу дикого типа. Это связано с тем, что каждый мутантный аллель имеет свой участок повреждения.

 → N

 → N

 → мутант

Генные продукты (белки) в цитоплазме могут взаимодействовать.

 

 

Т.о. в результате исследований получили:

1. ген дробим, состоит из отдельных частей, расположенных в них в отдельном порядке и они могут независимо изменяться при мутациях. Единица мутации - мутон (нуклеотид).

2. ген не является единицей рекомбинации, т.к. кроссинговер может происходить внутри сложного гена. Единица рекомбинации – рекон.

3. ген является единицей функции, но действие гена в целом обусловлено интеграцией его отдельных частей