Генетическая инженерия и биотехнология

Генетическая инженерия – это область молекулярной генетики, разрабатывающая методы конструирования новых функционально активных генетических программ. В 1972 г. П.Берг в США создал первую рекомбинантную молекулу ДНК. Важную роль в генетической инженерии играют ферменты, с помощью которых можно получать определенные фрагменты ДНК и сшивать их, например рестриктазы (рестригирующие эндонуклеазы) и лигазы, которые лишены видовой специфичности, поэтому можно получать фрагменты ДНК и сшивать их независимо от того, из одного или разных организмов они выделены. В 1977 г. Сенжером Ф. И Гильбертом У. был разработан метод секвенирования (расшифровки) первичной структуры ДНК, который позволяет определить последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК с предельным разрешением в один нуклеотид.

Генная инженерия решает следующие задачи:

· Синтез или выделение соответствующего гена;

· Включение данного гена в вектор, обеспечивающий его размножение (клонирование);

· Осуществление переноса гена с помощью вектора в клетку-реципиент и включение в ее геном (трансгенез);

· Функционирование гена в клетке-реципиенте (адаптация гена).

Биотехнология – это наука использования живых организмов и биологических процессов в производстве. Современная биотехнология представляет собой новую форму промышленной технологии, основу которой составляют биологические объекты – животные, растения, ткани различных органов, соматические клетки, размножаемые вне организма, микроорганизмы – бактерии, грибы.

Получение генов

Известны два способа искусственного синтеза генов вне организма – химический и ферментативный. В 1969 г. американский ученый Корана синтезировал ген аланиновой тРНК дрожжей химическим путем. Этот ген включал 77 пар нуклеотидов, последовательность которых была уже расшифрована. Сначала синтезировали фрагменты ДНК длиной от 5 до 12 нуклеотидов, затем соединили их в определенном порядке при помощи открытого к тому времени фермента лигазы. Ген не функционировал, так как не имел регуляторных элементов – промотора, где локализована точка инициации синтеза, и терминальных кодонов, которые дают сигнал о завершении синтеза иРНК.

В 1976 г.Корана с сотрудниками по той же методике завершили работу по химическому синтезу отрезка ДНК кишечной палочки, включающего ген супрессорной тирозиновой тРНК протяженностью 126 пар нуклеотидов и примыкающие к нему два регуляторных участка: промотор, содержащий 52 пары нуклеотидов, и терминатор – 21 пару, и прикрепленные к концам отрезка тетрануклеотиды (липкие концы) ААТТ и ТТАА. В этом случае искусственно синтезированный ген при введении в живую кишечную палочку оказался работоспособным.

В 1970 г. Темин, Мизутани и Балтимор обнаружили фермент обратную транскриптазу (ревертазу). В 1972 г. было открыто, что некоторые онкогенные вирусы при помощи фермента обратной транскриптазы могут синтезировать ДНК, используя в качестве матрицы РНК (и даже синтетические полирибонуклеотиды).

Под ферментативным синтезом гена имеют в виду транскрибирование комплементарной нити ДНК (гена) на молекулах РНК в пробирке. В пробирку, содержащую физиологическую бесклеточную среду, вносят дезоксинуклеотидтрифосфаты всех четырех типов (А, Г, Т, Ц), фермент ревертазу, мРНК, кодированную природным геном, копию которого планируется получить. В качестве «затравки», ускоряющей реакцию, вносят небольшие участки молекулы ДНК, содержащие 8-10 повторов тимина. На мРНК обратная транскриптаза синтезирует комплементарную ей нить ДНК. Затем на синтезированной нити ДНК строится вторая комплементарная ей нить ДНК. В результате получают фрагмент двойной спирали ДНК – точную копию того гена, с которого была транскрибирована мРНК.

Выделение генов

Впервые выделить ген методом трансдукции удалось Дж. Бексвиту с сотрудниками. Они показали, что бактериофаг Y при размножении в клетке E.coli может захватить и встроить в свой геном полный лактозный оперон бактерии вместе с примыкающим к нему геном-регулятором. Фрагмент ДНК E.coli встраивается в геном фага Y встрогом порядке: структурные гены z, a, y, оператор - o, промотор p и регулятор i. Применением денатурации и центрифугирования из ДНК-фага был выделен лактозный оперон и ген-регулятор E.coli. Этот метод выявился специфичным и не пригодным для широкого использования. В настоящее время генетическая инженерия использует методы, позволяющие одновременно выделить из молекулы ДНК фрагмент соответствующего гена и встроить его в вектор, посредством которого он может быть размножен и включен в геном клетки-реципиента.

Фрагменты ДНК содержащие ген, чаще всего получают с помощью ферментов – рестриктаз. Эти ферменты разрезают молекулу ДНК в строго определенном месте, где находятся нуклеотиды, распознаваемые данной рестриктазой. Векторами могут быть плазмиды, бактериофаги (см. раздел биохимическая генетика), вирусы, космиды. Векторы включают фрагменты ДНК, соответствующие определенному гену, и переносят их в клетку-реципиент (рис.1, 2).

Плазмиды – мелкие кольцевые молекулы ДНК, присутствующие в клетках бактерий. Они содержат дополнительную генетическую информацию, способны автономно, независимо от ДНК хромосом, реплицироваться; некоторые плазмиды обладают способностью встраиваться в хромосому бактерии и выходить из нее; некоторые могут переходить из одной клетки в другую. В генетической инженерии наиболее широко используется три типа плазмид F, P и Col. Метод создания рекомбинантных плазмид был разработан П.Бергом в 1972г. Ими была создана рекомбинантная плазмида, содержащая галактозный оперон E.coli. В плазмиду могут быть включены природные или синтезированные гены. После проникновения в клетку бактерии рекомбинантная плазмида может функционировать и размножаться автономно, либо включаться в ДНК хромосомы бактерии. Таким методом в клетки бактерии были введены гены человека и созданы штаммы бактерий-суперпродуценто соматостатина, интерферона, инсулина, гормоны роста человека, быка, глобин животных и человека.

Вирусы – используют в качестве векторов, проникающих в животные клетки. Наиболее широко в генетической инженерии используют обезьяний онкогенный вирус ОВ40. Геном этого вируса обладает способностью встраиваться в хромосомы клеток млекопитающих. Таким образом цепи гемоглобина мыши и кролика были перенесены в клетки обезьян, где они активно функционировали.

Космиды – векторы, полученные путем объединения небольших фрагментов ДНК бактериофага Y и плазмид. Космиды содержат гены, обеспечивающие их размножение в бактерии (например, ген устойчивости к антибиотику тетрациклину). С помощью этих векторов гены могут быть перенесены в бактериальные, растительные и животные клетки, культивируемые iv vitro.

Производство инсулина

В 1980 г. с помощью плазмиды в клетки T.coli был введен ген, контролирующий синтез инсулина человека. Для этого из клеток человека была выделена зрелая мРНК, кодирующая синтез инсулина. С помощью обратной транскриптазы с этой м-РНК была получена комплементарная копия – кДНК. Цепочка мРНК была разрушена и с помощью фермента ДНК-полимеразы синтезировали вторую комплементарную нить ДНК. Чтобы синтезированный ген можно было встроить в вектор, к его концу с помощью фермента лигазы были «пришиты» короткие нуклеотидные последовательности – линкеры, которые узнаются рестриктазой Бам 1. Плазмиду и кДНК обрабатывают рестриктазой Бам 1, затем ферментом лигазой и получают рекомбинантную плазмиду, которую вводят в клетку бактерии, приобретающей способность синтезировать про-инсулин.

Биотехнология соматотропина

В 1977 г. Г.Бойер с сотрудниками химическим путем синтезировал ген соматостатина – гормона роста человека. Ранее было определено, что соматостатин включает 14 аминокислот. Была известна и последовательность расположения аминокислот в этом пептиде. На основании этих данных авторы определили последовательность нуклеотидов и синтезировали участок ДНК, соответствовавший гену соматостатина. С целью защиты полученного гена от разрушения ферментами было решено соединить его с геном белка, вырабатываемого клеткой-хозяина. Ген соматостатина присоединили к отрезку галактозного оперона – гену галактозидазы кишечной палочки, который содержал и промотор для считывания этого гена. Как и предполагали ученые, наследственная информация считывалась с гена соматостатина сразу же вслед за геном галактозидазы. Для остановки считывания в коней гена соматостатина был включен кодон, не несущий информации. Для того, чтобы выделить соматостатин из полученного сложного белка, к началу его гена был включен кодон метионина. В качестве вектора использовали рекомбинантную молекулу, которая состояла из небольшой плазмиды, сконструированной заранее с введенным в нее геном pBR322-галактозидазы. После введения рекомбинантной молекулы в кишечную палочку в общем белке клетки, как и ожидалось, обнаружился соматостатин.

Биотехнология производства интерферона (IFN).

 Интерфероны используются в ветеринарной практике для профилактики и лечения вирусных заболеваний, как противоопухолевое средство для лечения раковых заболеваний; являются иммуномодуляторами, выступая при этом в качестве регуляторов иммунных реакций; проявляют антимикробную активность и радиозащитное действие.

Разработка биотехнологии производства интерферона – сложный процесс, требующий строгой регламентации действий на многочисленных этапах. Рассмотрим получение интерферона с помощью технологии рекомбинантной ДНК. Рекомбинантную молекулу ДНК получают встраиванием определенных генов в ДНК. С помощью ферменто-рестриктаз «разрезают» участки исходной ДНК и выделяют нужные гены. Другой фермент – лигаза – «вшивает» гены в новую ДНК. Микроорганизмы с рекомбинантной ДНК при их выращивании производят нужный продукт.

Вначале выделенную из крови доноров и находящуюся в культуре суспензию лейкоцитарных клеток обрабатывают вирусом, оказывающим индуцирующий эффект на биосинтез интерферона. В дальнейшем из лейкоцитов получают иРНК, программирующую биосинтез интерферона. Даже в индуцированных вирусом Сендай лейкоцитах иРНК содержится не более 0,1 % (Смородинцев А.А., 1985).

С помощью фермента обратной трансриптазы (ревертазы) на полинуклеотидной основе иРНК синтезируют комплементарную ей одноцепочечную копию ДНК (кДНК). Этому этапу предшествует синтез дезоксирибонуклеотида – затравки, состоящей из 32 мононуклеотидов, которая при гибридизации взаимодействует с соответствующим комплементарным участком выделенной из лейкоцитов иРНК и в дальнейшем выступает в качестве стартовой отметки, от которой начинается РНК-зависимый синтез одной из цепей ДНК (кДНК).

На следующем этапе на отделенной от гибридной структуры ДНК –РНК одноцепочечной кДНК осуществляется биосинтез второй комплементарной цепи ДНК. Чтобы обеспечить в синтезированной к ДНК комплементарность липких концов, к ним присоединяются линкеры (переходники). Они являются синтезированными химическим путем короткими участками ДНК, имеющими разные липкие концы. Обработка рестрикционной эндонуклеазой концов кДНК, а также подобранной плазмиды вектора. Которая в результате ферментативного гидролиза расщепляется рестриктазой с образованием линейной молекулы ДНК с липкими концами, позволяет соединить кДНК с плазмидой и благодаря липким концам и с помощью ДНК-лигазы образовать кольцевидную рекомбинантную плазмиду с синтезированной кДНК, в которой находится ген, кодирующий биосинтез а-интерферона.

Затем рекомбинантную плазмиду необходимо ввести в бактериальную клетку. Следующий этап – поиск бактериальной клетки, содержащей ген интерферона. По такому признаку, как способность к гибридизации, идентифицируют бактерии, содержащие рекомбинантные плазмиды с включенным в них геном, кодирующим синтез интерферона. Эти рекомбинантные плазмиды из бактерий выделяют и с помощью рестриктаз получают гены интерферона. Эукариотический интерфероновый ген в бактериальной клетке кодирует синтез «сырого» интерферона, для превращения которого зрелый интерферон в эукариотических клетках нет необходимых условий. Для преодоления этого препятствия эукариотический ген в условиях in vitro перестраивают, удаляя соответствующей рестриктазой ту часть нуклеотидов, которые кодируют информацию, не входящую в молекулу функционального интерферона. При этом в ходе рестриктазной реакции получается «перебор». Одновременно удаляется триплет, кодирующий синтез первой аминокислоты в полипептидной цепи интерферона. Этот, а также предшествующий ему инициирующий биосинтез полипептидной цепи кодоны синтезируют химическим путем и присоединяют к гену интерферона. Созданный в результате сложных манимуляций ген переносится в плазмиду, где он совмещается с бактериальным промотором, а затем вводится в бактериальную клетку-хозяин. Таким сложным многоэтапным путем создан штамм-продуцент E.coli. В 1 л бактериальной суспензии, содержащей около 10¹¹ клеток, концентрация а-интерферона достигает 5 мг, что в 5 тыс. раз больше того количества, которое можно получить из 1 л донорской крови.

Можно синтезировать интерферон химическим путем.

Для биотехнологического производства интерферона с выделением и очисткой ИФН, который, синтезируясь, остается в бактерии, получают моноклональные антитела к соответствующемй интерферону, прикрепляют их к полисахаридным шарикам, через слой которых пропускают после разрушения бактерий смесь белков. Интерферон взаимодействует с антителами и задерживается на полисахаридных шариках, с которых затем смывается в виде препарата высокой степени чистоты.

Имеются результаты применения человеческого интерферона против рота- и коронавирусов крупного рогатого скота в тканевой культуре и в производственных условиях на телятах (во время поения по одной желатиновой капсуле)

Биотехнология получения и использования ферментов

Получить необходимое количество ферментов за счет таких источников, как ткани растений и животных, невозможно. Единственным, неограниченным источником ферментов являются микроорганизмы, из которых можно выделить любые из известных в настоящее время ферментов. Синтезируемые микроорганизмами ферменты подразделяются на внеклеточные (гидролазы) и внутриклеточные. Скорость биосинтеза внеклеточных ферментов достаточно высокая. Продуктивность штаммов микроорганизмов, производящих ферменты, можно увеличить под действием мутагенных факторов в 2-5 раз; пересадкой плазмид получают штаммы продуцентов, количество целевого фермента в которых достигает 50% общей массы синтезируемого белка. В качестве источника углерода для микроорганизмов могут быть углеводы, спирты, карбоновые кислоты, углеводороды. Источником азота могут быть как органические (белки, пептиды, аминокислоты), так и минеральные (соли аммония, аммиак) вещества, а также атмосферный азот. Для получения препаратов ферментов культуры микроорганизмов выращивают на твердых питательных средах – поверхностный способ (Пх), на жидких питательных средах – глубинный способ (Гх) и применяют способ непрерывного культивирования.

Из культуральной жидкости, предварительно отделенной от микробных клеток, получают внеклеточные ферменты. Чтобы выделить внутриклеточные ферменты, необходимо разрушить клеточные оболочки.

Для проведения дезинтеграции клеток используются механические (баллистический, экструзионный, декомпрессионный), физические (осмотический шок, термошок, плазмолиз, замораживание –оттаивание, высушивание клеток, ультразвук, ионизирующая радиация), химические (действие кислот, щелочей, солей, органических растворителей, поверхностно-активных веществ), энзиматические (действие лизоцима, сока улитки и др. литических ферментов) и биологические (ингибирование биосинтеза клеточной оболочки, действие фагов, получение мутантных форм микроорганизмов – продуцентов ферментов с легко разрушающимися клеточными стенками) методы.

Для достижения необходимой степени чистоты ферментного препарата применяют метод разделения, основанный на неодинаковой растворимости белков. Осаждение белков без потерь их каталитической активности проводят солями неорганических кислот, например, сульфата аммония, а также органическими растворителями (этанолом, ацетоном, диоксаном, полиэтиленгликолем, декстраном). Высокая степень чистоты ферментов может достигаться с помощью хроматографии (адсорбционной, гидрофобной, ковалентной, ионнообменной, распределительной, аффинной и гель-хроматографии), проводимой на гелях агарозы, полиакриламида, целлюлозы и т.д.

Клеточная инженерия. Гибридизация в культурах клеток высших организмов разных видов.

Клеточная инженерия – метод конструирования клеток нового типа на основе культивирования, гибридизации и реконструкции.

Гибридизация – процесс образования или получения гибридов, в основе которого лежит объединение генетического материала разных клеток в одной клетке. Различают внутривидовую и отдаленную (между разными видами) гибридизацию. Гибридизация соматических клеток заключается в слиянии их ядер с образованием общего.

Сущность гибридизации соматических клеток заключается в соединении клеток с хромосомными наборами систематически далеких форм. Впервые возможность гибридизации клеток, культивируемых вне организма, установил в 1960 г. Ж.Барский. В 1965 г. Харрис обнаружил, что эффективность гибридизации соматических клеток резко повышается при обработке их инактивируемым парагриппозным вирусом Сендай. При помощи вируса Сендай, индуцированного ультрафиолетом, получены гибриды клеток многих далеких видов (мыши и курицы, мула и мыши, кролика и обезьяны, человека и курицы, коровы и норки). Из таких гибридных клеток не удается получить единый организм с суммой родительских признаков. Ученые проводят соматическую гибридизацию с целью изучения поведения разных хромосом в гибридной клетке. Способность клеток объединяться и образовывать гибриды нашла широкое применение в иммунологии (моноклональные (чистые) антитела определенной специфичности). С помощью моноклональных антител получают иммуносорбенты для производства ферментов, гормонов, интерферонов. Создаются химические «контейнеры», способные нести лекарственный препарат в определенный участок организма. Создана очень ценная гибридома на основе лимфоцитов-киллеров, обеспечивающих защиту организма от чужеродных клеток, в том числе раковых. Эти лимфоциты нападают на раковую клетку и вызывают ее гибель.

Биотехнология антител.

Как указывают В.Сюрин и В.Смоленский (1987), получение моноклональных антител открывает совершенно новые возможности не только в области диагностики заболеваний, идентификации и дифференциации возбудителей, но и при анализе структуры эпитопов вирусов, очистке антигенов, изучении иммунной системы организма, создании вакцин, получаемых посредством молекулярного клонирования или химического синтеза, при лечении некоторых вирусных болезней.

Для получения моноклональных антител против определенного эпитопа антигена после иммунизации животного необходимо соответствующую антителообразующую плазматическую клетку изолировать, а затем размножить ее в клеточной культуре. Преодолеть возникший баръер удалось созданием гибридных клеток, образующих определенные антитела.

Г.Келлер и С.Мильштейн (1975) создали в пробирочных условиях так называемую гибридому, являющуюся носителем свойств клеток, участвовавших в фузии (слиянии). Так как в качестве исходных для получения гибрида были взяты антителообразующая клетка (АОК) селезенки и быстроделящаяся раковая (миеломная) клетка, продукт слияния их обладал способностью к практически бесконечному размножению в клеточной культуре и как исходный лимфоцит – к биосинтезу одного определенного вида антител.

Среди полученных гибридом идентифицируют те клоны, которые образуют антитела определенной специфичности. Культивируют отселекционированный клон гибридомных клеток или в виде асцитной опухоли, вводя гибридомную клеточную взвесь мышам внутрибрюшинно, или в виде перевиваемой клеточной культуры. Титр моноклональных антител, содержащийся в асцитической жидкости, на 2-3 порядка превосходит то их количество, которое находится в культуральной среде. Несмотря на столь значительные расхождения в концентрации моноклональных антител, получение их в условиях клеточной культуры имеет существенные преимущества, обусловленные выделением антител из культуральной среды и последующей очисткой, а также более благоприятными условиями для контроля процесса биосинтеза.

Моноклональные антитела используются в ветеринарии для создания диагностических препаратов вирусных инфекций, а также для тестирования состава крови (клеточные популяции, иммуноглобулины и т.д.) и других биологических жидкостей.

В настоящее время созданы гибридомы, в которых происходит биосинтез моноклональных антител к антигенным детерминантам вируса венесуэльского энцефалита лошадей, африканской чумы свиней, лейкоза, бешенства, гриппа и др. Эти препараты высокочувствительны и высокоспецифичны, их можно стандартизировать. Имеются данные о повышении эффективности таких диагностикумов, как иммуноферментный анализ (ИФА), реакция пассивной гемаагглютинации, иимунофлуоресцентный метод. Иммобилизированные антитела используются в качестве иммуносорбентов, обеспечивая одноступенчатость процесса, при очистке таких биологически активных веществ, как инсулин, интерферон, соматотропный гормон и других, биосинтез которых основан на использовании технологии рекомбинантных ДНК.

Получение аллофенных животных

Аллофенными называют химерные организмы, содержащие разные ткани, произошедшие из клеток, полученных от разных родителей. Созданы аллофенные мыши путем образования смешанной бластулы из клеток черных и белых мышей. Эмбрионы мышей извлекали на стадии восьми бластомеров и с помощью фермента проназы отделяли бластомеры. Комбинируя бластомеры от двух (и более) эмбрионов, создали в специальной питательной среде единый комплексный эмбрион, который ввели в матку мыши, гормонально подготовленной к имплантации зародыша. Рождавшиеся мышата представляли собой мозаиков с признаками всех родительских форм. Были созданы мыши с крысиными клетками (гигантские мыши).

 

Лекция 13

Генетика онтогенеза.

Медицинская генетика.

Онтогенезом называется индивидуальное развитие организма, начиная от оплодотворенной яйцеклетки и заканчивая смертью. В оплодотворенной яйцеклетке соединяются гены отцовского и материнского организма, и из одной этой клетки путем многочисленных делений возникает очень сложный многоклеточный организм. Онтогенез каждой особи подчиняется биогенетическому закону Мюллера-Геккеля: сходство эмбриональных черт развития отражает степень родства разных форм в силу общности их происхождения. Для позвоночных характерно прохождение стадии, на которой у наземных форм, дышащих легкими, образуются жаберные дуги, как и у рыб. Вместе с тем, необходимо учитывать и различия в онтогенезе у разных форм, которые накладываются на общий характер развития, что свидетельствует о специфике генетической информации. Так, например, в яйцах рыб и птиц содержатся большие запасы желтка, что сказывается на их эмбриогенезе. Проявление различий между клетками в процессе эмбриогенеза называют дифференцировкой. В период дифференцировки клеток активно функционируют гены, контролирующие синтез специфических белков, необходимых для формообразовательных процессов и интеграции специализированных клеток. Основной проблемой генетики онтогенеза является выяснение вопроса о том, каким образом из одной единственной клетки возникает множество разнообразных типов клеток, значительно различающихся между собой по строению, функции и химическим особенностям, как в процессе онтогенеза идет становление признаков и свойств организма.

На развитие признаков организма влияют гены. По теории Бидла и Татума один ген – один фермент каждый ген имеет только одну первичную функцию – определять синтез только одного фермента. Изменение в структуре гена, кодирующего определенный фермент, ведет к его выключению. Если этот фермент не участвует в последовательной цепи реакций, то синтез определенного вещества в организме приостанавливается на стадии, для которой этот фермент был необходим. При этом возникает новый признак. Характер индивидуального развития высших организмов определяется взаимодействием многих генов, сложным взаимодействием ядра и цитоплазмы, различных клеточных систем, обладающих активностью разных генов. На рисунке приведена схема взаимоотношений звеньев цепи онтогенетических процессов у многоклеточных организмов по Конюхову Б.В. с детализацией Гершензона С.М. (Петухов, с 201).

Влияние среды на развитие признаков

Фенотип каждого организма формируется под влиянием генотипа и внешней среды. Генотип определяет норму реакции организма – границы изменчивости выражения признака под влиянием изменяющихся условий окружающей среды (модификации). При изменении условий среды иногда признак изменяется так же, как и под влиянием действия генов, но возникшие особенности не являются наследственными (фенокопии). У сельскохозяйственных животных среда оказывает особенно большое влияние на развитие хозяйственно полезных признаков. Неблагоприятные условия кормления и содержания в первую очередь воздействуют на высокопродуктивных животных. Животные с хорошим генотипом не могут реализовать всех своих возможностей и уклоняются в сторону низкопродуктивных животных. Изучая близнецов, можно получить данные о том, в какой степени среда может модифицировать проявление патологических симптомов определенной болезни.

Роль генетической информации на начальных стадиях эмбриогенеза

У животных в яйцеклетке до оплодотворения накапливается (в цитоплазме) большое количество рибонуклеиновых кислот всех типов: мРНК, рРНК и тРНК, - которые до оплодотворения находятся в неактивном состоянии. Они соединяются со специфическими белками-гистонами и образуют неактивные гранулы инфорсомы. После оплодотворения часть молекул мРНК инфорсом освобождается от белка, поступает на рибосомы цитоплазмы яйцеклетки и начинает синтез определенных белков, необходимых для начального развития зиготы. Осуществляется под контролем генов материнского организма. С начала стадии гаструляции и в дальнейших процессах онтогенеза синтез белка осуществляется под контролем ядерных генов обеих родительских особей. В некоторых случаях наблюдается наличие в цитоплазме яйцеклетки специальных фрагментов активной ДНК. Они синтезируют мРНК и кодируют синтез специфических белков в цитоплазме.

Критические периоды в развитии животных

Периоды, когда эмбрионы легко повреждаются, у них нарушаются процессы развития органов, что приводит к гибели либо к появлению уродств называются критическими. В это время в соответствии с генетической программой развития особи усиливается синтез соответствующих белков, прекращается синтез предшествующих веществ, происходит перестройка обмена веществ в клетке. Критические периоды наступают после поздней бластулы, когда дальнейшее развитие эмбриона осуществляется под контролем генетической информации обеих родительских особей. Наиболее изучены внешние факторы, влияющие в критические периоды на процесс онтогенеза у рыб, птиц (температура воды, содержание в ней кислорода; температура инкубации, влажность воздуха). У кур критическими периодами эмбриогенеза принято считать 2-3 сутки инкубации – образование кровообращения, 8-9 сутки – интенсивный морфогенез и 19 сутки – переход зародыша к легочному типу дыхания. У крупного рогатого скота наблюдается повышение смертности в первые 3 дня развития зиготы, что свидетельствует о критическом периоде. В критические периоды, очевидно, происходит смена матриц белкового синтеза и в связи с этим ослабление физиологических процессов. В опытах Г.Н.Шангина-Березовского с сотрудниками однократное воздействие микродозами супермутагенов способствовало повышению жизнеспособности цыплят и увеличению живой массы молодняка в опытных группах к 2-месячному возрасту у птиц мясного направления на 80-100г.

Возрастные изменения состава белков

На ранних стадиях онтогенеза у человека идет образование гемоглобина F, который состоит из двух цепе полипептидов – альфа и гамма. С 13 недели эмбрионального развития начинается синтез гемоглобина А, характерного для взрослого человека. У гемоглобина А цепь полипептида гамма заменена на цепь бетта несколько иного строения. Цепь альфа у обоих гемоглобинов одинакова, и ее синтез контролируется одним и тем же геном. У телят полная замена гемоглобина F на гемоглобин А произошла к 110 дню. Обнаружены существенные возрастные изменения в количестве и составе белков сыворотки крови у телят в эмбриональный период в породном аспекте. Первый период эмбрионального развития характеризуется низким содержанием сывороточных белков. С увеличением возраста плода происходит качественное изменение состава белка, отношение альбуминов к глобулинам возрастает от 0,4 у 2-месячного плода до 1,21 к моменту рождения. Существенно изменяются функции глобулинов. В постэмбриональный период также наблюдаются изменения белкового спектра сыворотки крови. По данным Гурьяновой А.С., у телок бурой латвийской породы содержание общего белка сыворотки крови с 3- до 18-месячного возраста возросло с 6,12 до 7,54г%, в том числе глобулинов с 3,03 до 4,24г%. Существенные изменения отмечены во фракциях глобулинов. Возросло количество альфа-глобулина с 0,89 до 1,29г%, гамма-глобулина - с 1,01 до 2,06г%, содержание бетта-глобулина снизилось с 1,13 до 0,88г%.

Некоторые органы и ткани специализируются на синтезе каких-то определенных белков, и количество РНК в них в отдельные периоды возрастаеи или снижается. И.Я.Шихов изучал содержание ДНК и РНК в вымени телок, нетелей и коров. Он обнаружил, что отношение количества РНК к количеству ДНК составляет в среднем: у половозрелых телок – 0,48, у нетелей и коров в конце стельности – 1, у коров в начале лактации – 2,34 (с большими колебаниями у отдельных животных), в конце лактации – 1,72. Наблюдалась высокая степень связи между содержанием РНК в вымени и удоем коров. Это показывает, что образование РНК усиливается при высоких удоях, когда в вымени коров синтезируется много белка, и снижается при уменьшении удоев.

Взаимодействие ядра и цитоплазмы

в индивидуальном развитии животных

Цитоплазма играет важную роль в реализации наследственной информации и формировании некоторых признаков организма. Известно, что основная часть цитоплазмы поступает в зиготу с яйцеклеткой и отличается от цитоплазмы соматических клеток большим разнообразием белков, РНК и других видов молекул, синтезированных в овогенезе. В результате неодинакового распределения веществ в цитоплазме яйцеклетки (ооплазматическая сегрегация), при дроблении зиготы идет неравнозначное распределение веществ (РНК, белков и др.) в бластомеры (Бовери, Конклин, Дриш). Герден установил, что в цитоплазме яйцеклетки имеются активатор синтеза ДНК и репрессор синтеза РНК, которые действуют независимо друг от друга. Некоторые органоиды цитоплазмы, имеющие свою систему белкового синтеза (митохондрии, пластиды), могут влиять на развитие определенных признаков. Наследование признаков через цитоплазму получило название цитоплазматической наследственности. Хаджиновымм М.И. и Роде М. открыта цитоплазматическая мужская стерильность у кукурузы, обусловленная цитоплазматическим геном цит^s. Но в этом случае имеет место и контролирующая роль ядра. Стерильность пыльцы наблюдается только при наличии гена в ядре в гомозиготном состоянии. При наличии доминантного гена (гетеро- или гомозиготное состояние) стерильность пыльцы не развивается. В целом же у растений и особенно у животных определяющую роль в наследственности играет ядро.

Обнаружены случаи ложной наследственности – передачи по материнской линии патогенных возбудителей. Куры передают цыплятам через желток возбудителя бациллярного белого поноса (Salmonella pullorum). В этом случае передача бактерий от одного поколения другому осуществляется, безусловно, через цитоплазму, но бактерия не является обычным ее компонентом. Это патогенный агент, а не плазмоген.

Регуляция синтеза белков

Процесс регуляции синтеза белков разработан Ф.Жакобом и Ж.Моно и получил название механизма индукции-репрессии. Этот процесс был изучен на кишечной палочке. Гены, влияющие на синтез какого-то фермента или белка, расположены в молекуле ДНК последовательно друг за другом в порядке их влияния на ход реакции синтеза были названы структурными генами. Перед группой структурных генов расположен общий для них ген-оператор, а перед ним – промотор. Функциональная группа, состоящая из промотора, оператора и структурных генов называется опероном. На структурных генах оперона образуется одна общая молекула иРНК (полицистронная иРНК), так как структурные гены находятся одновременно в активном и неактивном состоянии. В той же молекуле ДНК на некотором расстоянии, расположен ген-регулятор, под контролем которого вырабатывается белок, называемый репрессором. Роль репрессора может выполнять и вещество, синтезируемое в клетке, если содержание его превышает норму (нуклеотиды, аминокислоты). Молекула репрессора имеет два специфических участка – один для присоединения к оператору и один для связывания индуктора. Индуктором является определенное химическое соединение, которое служит материалом для синтеза фермента. Индуктор соединяется с репрессором и инактивирует его. Оператор освобождается, и начинается синтез и РНК на структурных генах и соответственно синтез фермента.

Механизм индукции-репрессии обеспечивает включение (индукцию) в работу тех генов, которые синтезируют необходимые на данном этапе жизнедеятельности клетки ферменты. Работа генов прекращается (репрессируется), когда деградируемый данными ферментами субстрат израсходован или когда синтезируемое данными ферментами вещество находится в избытке.

У высших организмов процесс регуляции работы генов осуществляется более сложно: у животных важную роль в этом играют гормоны, клеточные мембраны. Опероны эукариотических клеток состоят из структурного гена и регуляторных генов, управляющих их активностью. У эукариот возможно одновременное групповое подавление активности генов: во всем ядре, в целой хромосоме или в большом ее участке.. Предполагается, что такая репрессия генов осуществляется в значительной мере гистонами – основными белками, которые входят в состав хромосом эукариот. Примером групповой регуляции активности генов является полное прекращение транскрипции всех генов при сперматогенезе у животных.

Условно структурные гены эукариот могут быть разделены на 3 типа: гены, кодирующие ферменты энергетического обмена, ферменты, необходимые для синтеза аминокислот; гены, функционирующие в клетках тканей одного типа – гены контролирующие миозин в мышцах, коллаген в костях; гены специализированных клеток – синтез глобина в эритроцитах, гормонов в эндокринных железах.

Гормональная регуляция белкового синтеза