Сопоставление антигенных детерминант вно и вич, используемых для создания вакцин

ВНО и другие ортопоксвирусы представляют собой очень благодарный для иммунолога объект исследования, так как реакции иммунной системы человека на них всегда укладываются в представления об иммунитете и инфекции, сложившиеся еще в начале ХХ столетия. В таких исследованиях открывается обширное поле деятельности по детализации прописных истин из старых учебников, поэтому они всегда «глубоко научны». Но как мы увидим ниже, реакции иммунной системы на антигены ВИЧ не вмещаются в эти привычные рамки.

Антигенные детерминанты ВНО. Основной антигеной детерминантой поксвирусов и мишенью для протективных антител является консервативный белок L1 (другое название L1R). У вируса вакцины (так называют ортопоксвирус, используемый в настоящее время для вакцинации людей против ВНО), вируса оспы обезьян и ВНО этот белок различается отдельными аминокислотами. Антитела к L1 способны блокировать инвазию ортопоквирусов в клетки. Поэтому он рассматривается учеными в качестве кандидата на включение в перспективные противооспенные вакцины (рис. 7).

Рис. 7. Структура белка L1

А. Две проекции белка L1 на ленточной диаграмме. Фронтальный вид (верхнее изображение) показывает расположение спиралей на одной стороне молекулы, на другой стороне изображены параллельные бета-складки, сформированные непараллельными бетацепями, соединенными через петлю и тремя дисульфидными связями. Нижняя проекция показывает бета3, бета4 и альфа5, упакованные вблизи центра молекулы. Обозначены спирали (альфа1-альфа5), N-конец (N), и С-конец (С).

Б. Вверху показан димер L1. Взаимодействие двух L1 молекул происходит через края бета-складок. Нижнее изображение показывает L1 со стороны бета-складок (темная область). L1 – это крупная консервативная белковая молекула-мономер с несколькими конформационными эпитопами, презентируется иммунным клеткам в виде хоорошо им заметного димера (Su Hua-Poo, 2005).

По данным H. Su et al. (2005), L1 играет основную роль в «созревании» вирионов ортопоксвирусов. На заключительной стадии морфогенеза вируса образуются так называемые внутриклеточные созревающие вирионы (intracellular mature virions, IMVs), которые имеют липидные мембраны и представляют собой уже способные к инфекции формы вируса. Большинство IMV высвобождаются из фагоцитирующей клетки после ее лизиса. Некоторые из них могут транспортироваться через клеточную мембрану хозяина до лизиса клетки. После чего они остаются присоединенными к ее наружной поверхности или отделяются от нее уже как внеклеточный оболочечный вирус (extracellular enveloped virus, EEV). Главную роль в передаче вируса от одного хозяина к другому играет его IMV-форма. L1 представляет собой миристиолированный оболоченый белок (myristoylated envelope protein), состоящий из 250 аминокислотных остатков. Он экспрессируется на поверхности IMV-формы вируса. Его C-гидрофобный сегмент погружен в вирусную мембрану, но консервативная часть L1, включающая 185 аминокислотных остатков, локализуется в цитоплазме клетки-хозяина. В области N-конца белка формируется гидрофобная «каверна», необходимая для сборки вириона. После лизиса клетки этот эктодомен экспонируется Т- и В-клеткам иммунной системы, и вызывает сильный ответ с их стороны. Следовательно, ключевая роль белка L1 в морфогенезе вируса предопределяет его консервативность как антигена. Поэтому другого варианта поддержания в популяциях человека, кроме как эстафетной смены хозяина воздущно-капельным путем, у ВНО нет.

Вакцинация обычно предупреждает заражение ВНО в течение, по меньшей мере, 5-10 лет. При развитии болезни ее симптомы у вакцинированных лиц менее выражены, чем у невакцинированных. Так как специфические антитела считаются «первой линией обороны» против вторжения возбудителей инфекционных болезней, их обычно выявляют для оценки иммунной защиты индивидуума. По данным Gallwitz S. et al. (2003), использовавших ферментативный иммуноанализ для поиска антител к вирусу вакцины у лиц, вакцинированных 30-60 лет назад, их можно обнаружить у 65% обследуемых, вакцинированных однократно; и у 80 % обследуемых, вакцинированных два раза и более. Crotty S. et al. (2003) продемонстрировали присутствие у лиц, вакцинированных более 50 лет назад, В-клеток памяти, специфических к вирусу вакцины. Количество таких клеток после вакцинации снижается течение нескольких лет до уровня, представляющего примерно десятую часть от достигнутого максимума. Далее количество противооспенных антител (0,1% от общего количества IgG⁺ B-клеток) не меняется практически на протяжении всей оставшейся жизни вакцинированного. Этим объясняется выраженная антительная реакция на противооспенную ревакцинацию. В опытах Frey S.E. et al. (2003) вакцинация ранее вакцинированных лиц давала очень хороший результат даже при десятикратном разведении вакцины. Теперь, когда мы получили представление об антигенных детерминантах ВНО, нам проще будет понять, почему антигенные детерминанты ВИЧ не могут быть использованы для конструирования ВИЧ-вакцин.

Антигенные детерминанты ВИЧ. В-клеточные ответы на ВИЧ-инфекцию, многообразны. У людей, инфицированных ВИЧ, обнаруживают антитела к его структурным (p17, p24, gp4l, gpl20) и регуляторным белкам (vif, nef, RT), а также аутоантитела. Основным изотипом синтезируемых антител является IgGI (более подробно см. у J. E. Bovis, K. James, 1992; и у Е. Н. Шуваловой с соавт., 2001). Основной антигенный раздражитель системы Т- и В-иммунитета, это оболочечный шип (spike) ВИЧ. Он состоит из тримера гетеродимеров (trimer of heterodimers), сформированных двумя гликопротеинами, gp120 и gp41. Гликопротеин gp120 представляет собой высоко гликозилированный белок, приблизительно половина массы которого составляют карбонгидраты, присоединенные к N-концу молекулы (Poignard P. et al., 2001). Анализ последовательностей различных изолятов ВИЧ позволил установить у gp120 вариабельные (V1-V5) и консервативные (С1-С5) регионы (рис. 8).

Рис. 8. Топография поверхности вириона ВИЧ-1

Оболочечные гликопротеины (gp120/gp41) изображены как тетрамерные олигомеры. Карбонгидратный комплекс, включающий преимущественно олигоманнозу, изображен в виде «облака» вокруг гликопротеина. Показано антитело (IgG), нейтрализующее ВИЧ. Оно не может взаимодействовать с gp120/gp41, потому что гликопротеин экранирован карбонгидратным комплексом. В то же время сайт связывания с рецептором CD4 Т-лимфоцитов остается открытым (Nara P.L. et al., 1991).

Гликопротеины имеют рецепторный сайт для CD4-молекулы, определяющей тропизм ВИЧ к CD4 Т-клетки; и второй сайт — связывающий вирус с хемокиновыми корецепторами, обычно с CCR5 и CXCR4. Поверхность кора gp120 закрыта карбонгидратами, а большая часть оставшейся не экранированной молекулы вовлечена во взаимодействие с gp41 или с другими единицами gp120 в трехмерном шипообразном выступе оболочки. Относительно консервативный сайт связывания с CD4 «заглублен» и малодоступен для антител. Консервативный корецепторный сайт является наиболее недоступным для антител даже на мономерном gp120. Роль gp120 в инфекционном процессе в основном заключается в связывании вируса с клетками-мишенями и обеспечении ему тесного соприкосновения с мембранами таких клеток. Трансмембранный белок gp41 играет ключевую роль на этой стадии взаимодействия вируса и клетки, так как он вызывает слияние вируса с мембраной клетки-мишени и доставляет генетический материал в ядро клетки. Этот белок относительно консервативен, но большая часть его поверхности скрыта от антител, распознающих шипообразные выступы оболочки (Zwick M. B. et al., 2004).

Вариабельные последовательности оболочки ВИЧ концентрируются в оболочечных петлях (V1 — V4), которые и являются главными целями для нейтрализующих антительных ответов иммунной системы человека. В оболочку ВИЧ входят также несколько белков человека. Но их роль как антигенов, незначительна.

Антитела с широким нейтрализующим действием. Здесь я сразу поясню, что в специальной литературе под ВИЧ-нейтрализующими антителами обычно понимаются те, которые нейтрализуют вирус в условиях in vitro. В условиях in vivo их действие очень сложно опосредовано, так как функция связывания с антигеном у антител не единственная. Более древней у них является эффекторная функция, т. е. способность передавать сигналы между клетками, взаимодействуя со специфическими рецепторами на их поверхности (например, известны антитела-агонисты рецепторов DR4 или DR5, вызывающие апоптоз раковых клеток; см. C. Odoux et al., 2002). К эффекторным функциям относится и способность антител, связываясь с антигеном активировать каскад протеолитических реакций, осуществляемых системой комплемента (более подробно об эффекторных функциях антител см. в работе А. Ройта с соавт., 2000). К этим аспектам проблемы я вернусь ниже, а пока нам надо условится о том, что в «чистом виде» феномен нейтрализации антителами ВИЧ или любого другого микроорганизма встречается только в эксперименте в условиях in vitro, т.е. «в пробирке».

Длительные исследования В-клеточных ответов на ВИЧ показали, что у людей появляются антитела, нейтрализующие доминирующий вариант вируса, но как только их уровень достигает определенного порога, селекционируется вариант вируса, способный избегать их нейтрализующее действие (Burton D.R. et al., 2005). Скорость появления как ВИЧ-нейтрализующих антител, так и избегающих их вирусов, сильно варьируют у разных лиц, однако сам цикл многократно повторяется на протяжении жизни ВИЧ-инфицированного и больного СПИДом человека (Frost S. et al., 2005).

Антитела, способные распознавать сразу несколько штаммов ВИЧ (антитела с широким нейтрализующим действием), появляются медленно и только у отдельных индивидуумов. Но так как их рассматривают уже в течение двух десятилетий в качестве средства для лечения и профилактики ВИЧ-инфекции, то локализация эпитопов на оболочке ВИЧ, вызывающих такие ответы, хорошо изучена (рис. 9).

Рис. 9. Локализация на оболочечных гликопротеинах ВИЧ/SIV эпитопов для антител с «широким нейтрализующим действием»