Люминесцентный микроскоп устроен также как и оптический.

Но вместо дневного света он имеет мощный источник света, максимум излучения которого находится в коротковолновой области видимого спектра, систему светофильтров, а также интерференционную светоделительную пластинку (или набор таких пластинок), применяемую при возбуждении люминесценции падающим светом.

1. В качестве источника для возбуждения люминесценции (получения ультрафиолетовых лучей) наиболее часто используются ртутно-кварцевые лампы сверхвысокого давления, а также ксеноновые лампы и кварцево-гало-генные лампы накаливания, работающих от сети (пусковой ток 6,2 а, рабочий ток–3,6 а). Ртутный пар лампы излучает ряд светосильных линий, которые отстоят друг от друга относительно далеко, так что между ними могут беспрепятственно выделяться флуоресцентные полосы.

Для возбуждения люминесценции при Л. м. пользуются также оптическими квантовыми генераторами – лазерами, излучение к-рых обладает высокой интенсивностью и монохроматичностью. При этом отпадает необходимость в применении возбуждающих светофильтров.

2. Применяют специальные фильтры, изолирующие ультрафиолетовые лучи определенной длины волны Светофильтры изолируют из ультрафиолетовой области лучи с длиной волн между 4000—3200 А, причем максимум пропускания соответствует длинам волн около 3600 А

Фильтры для люминесцентного анализа готовятся из силикатного стекла с примесью окисей никеля и кобальта (черное стекло).

3. Интерференционная светоделительная пластинка с нанесенными на нее слоями диэлектриков избирательно отражает на препарат более 90% света, возбуждающего люминесценцию, и почти полностью пропускает более длинноволновый свет люминесценции, что позволяет увеличить яркость люминесценции.

Методика исследования не сложна и заключается в том, что испытуемый объект помещают в наблюдательное пространство, зажигают лампу и наблюдают, появится ли люминесценция. Если люминесценция появляется, то отмечают характер ее, цвет, интенсивность, однородность.

4. Флуориметрический (или количественный флуоресцентный) анализ основан на выявлении зависимости между интенсивностью флуоресценции и концентрацией люминесцирующего вещества. Эти методы применимы в тех случаях, когда способностью к люминесценции обладает только определяемое вещество. В противном случае определению должны предшествовать операции по выделению и очистке определяемого вещества или маскированию примесей специальными реагентами.

Флуориметры (фотометры, флуорометры) – приборы для измерения интегральной интенсивности люминесценции, у которых для монохроматизации возбуждения или эмиссий/применяются светофильтры. Они могут быть построены как по однолучевой, так и по двулучевой оптической схеме. Конструктивно двулучевые флуориметры близки к фотоэлектроколориметрам и фотометрам.

Принцип работы флуориметров основан на сравнении интенсивности свечения исследуемого образца и эталона, у которого спектральный состав излучения одинаков или очень близок к излучению образца. Для выделения нужных участков спектра возбуждения и люминесценции используются светофильтры (абсорбционные или интерференционные).

Особенностью работы на флуориметрах является необходимость точного учета размеров излучающей поверхности образца и эталона. Для этой цели в конструкциях приборов предусматриваются щелевые, ирисовые диафрагмы или другие устройства.

Проточная цитофлюориметрия

Одним из вариантов количественной регистрации люминесценции микрообъектов является метод импульсной цитофлюорнметрии (цитофлюориметрии в потоке) и «сортировки» клеток по люминесцентным характеристикам. Эти методы позволяют проанализировать интенсивность люминесценции десятков тысяч клеток в минуту и провести их разделение по характеру люминесценции. Среди методов люминесцентного изучения микрообъектов наибольшее распространение получили прямое флюорохромирование – окрашивание флюорохромами и иммунофлюоресценция.

5. Спектрально-люминесцентный анализ основан на анализе спектра продукта и определении количественного вклада в него каждого компонента.

Спектральный анализ это в первую очередь качественный анализ.

Преимущество спектрального анализа перед флуориметрическим состоит в возможности одновременного определения сразу нескольких компонентов.

Для измерения спектральных характеристик люминесценции используются спектрофлуориметры и спектрофотометры.

Спектрофлуориметры – приборы, регистрирующие спектры люминесценции и спектры возбуждения, в которых вместо светофильтров используются монохроматоры. Оптической схемой и конструктивно они близки к спектрофотометрам. В отличие от флуориметров необходимые участки спектров выделяются монохроматорами.

рис 3. Схема спектральной установки для изучения собственнйо люминисценции пищевых продуктов

1- источник возбуждения; 2,4,6 – кварцевые конденсоры; 3,10-дифракционные монохроматоры4 5–поляризатор; 6- вакуумный кріостат; 7- исследуемый образец;9– аналізатор; 11- приемник люминисценции; 12- усилитель; 13- регистрирующий прибор.

 

Благодаря применению высокочувствительной спектральных установок с вакуумным криостатом для образцов многих пищевых продуктов были получены спектры собственной люминесценции, позволяющие достаточно надежно идентифицировать основные компоненты этих продуктов: белки, жиры, витамины, кислоты.

ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ

Хемилюминесцентный анализ (ХЛ анализ) – разновидность люминесцентного.

Он отличается тем, что не требует источников возбуждения. Излучение генерируется самой ХЛ системой. Для усиления хемилюминисценции в нем могут применятся флюорохромы.

По интенсивности хемилюминесценции можно судить о степени окисления, уровне свободных радикалов и отклонении его от нормы, что существенно, напр., при лучевом поражении сырья, или загрязнении радионуклидами. Хемилюминисценцию можно регистрировать даже от одной или нескольких клеток.

ХЛ может возникать в любой, химической реакции, сопровождающейся выделением энергии, достаточной для возбуждения электрона. К таким реакциям относятся радикальные и цепные, а также окислительно-восстановительные реакции, идущие по свободнорадикальному механизму.

В зависимости от агрегатного состояния "компонентов различают газофазные и жидкофазные ХЛ реакции.

В газовой фазе ХЛ наблюдается в основном в реакциях, идущих с большими скоростями при высоких концентрациях атомов и свободных радикалов (реакции в пламени, в атомизированных газах и др.), в реакциях окисления молекулярным кислородом предельных, непредельных, ациклических и ароматических углеводородов; спиртов; эфиров; альдегидов; в реакциях окислительного и термического распада органических перекисей, азотосоединений, галогенпроизводных и других соединений.

В жидкой фазе ХЛ сопровождает реакции окисления молекулярным кислородом, перекисью водорода, озоном, хлором, бромом, другими окислителями (углеводородо, спирто, альдегиды, кислоты, амины, амиды, аминокислоты углеводы, фенолы, азотсодержащие соединения); реакции термического и катализированного распада органических перекисей и гидроперекисей; реакции нейтрализации сильных кислот сильными основаниями; процессы электролиза органических и неорганических веществ; разложения воды амальгамами; реакции гидратации и дегидратации и др.

Большую группу жидкофазных ХЛ реакций представляют реакции окисления, протекающие с излучением, в тканях и клетках живых организмов – биохемилюминсиценция.

Свечение в этих реакциях связано с окислительными превращениями особого люциферин-люциферазного комплекса белковой природы.

Во всех тканях растений и животных, содержащих клеточные лнпиды, при их окислении обнаружена сверхслабая биохемилюминесценция (метаболическое излучение). Биохемилюминесценция наблюдается также при воздействиях на живые ткани, клетки или отдельные клеточные компоненты излучением, нагревом, электрическим током, ультразвуком н другими факторами.

Очень слабое излучение в ультрафиолетовой области наблюдается в реакциях, сопровождающих деление клеток (митогенетическое излучение).

Триболюминисценция

Хемилюминисценция трения (клеток крови, шуршання, кусання и хруста пищевых продуктов)

Для регистрации хемилюминисценции и триболюминисценции исполюзуются приборы хемилюминометры или триболюминометры, выпускаемые как отечественной промышленностью, так и заруюбежные варианты. Сейчас для анализа аллергических заболеваний используется такой метод как гемакод. Он также основан на хемилюминсицентном анализе.