Обнаружение энтеровирусов методом полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) с использованием культуры ткани для выявления репликативной «минус» нити РНК энтеровирусов

Для подтверждения инфекционности выделенных энтеровирусов проводят первичное заражение элюатом культуры клеток, через двое суток после культивирования зараженных клеток проводят ОТ-ПЦР с культуральной жидкостью при наличии ЦПД или с лизатом клеток культур тканей - при отсутствии ЦПД. Суть методики состоит в выявлении с помощью ПЦР негативной минус цепи («-» цепи) РНК энтеровирусов после их культивирования в культуре ткани. Негативная цепь является промежуточным продуктом репликации вируса, и её обнаружение служит косвенным доказательством потенциальной инфекционности вируса.

8.6.1. Заражение культур клеток и их последующая обработка

Для проведения ОТ-ПЦР следует использовать не менее двух культур клеток, учитывая их чувствительность к различным типам энтеровирусов. Рекомендуется использовать следующие сочетания клеточных культур: BGM и Нер-2 или Нер-2 и RD. В пробирках (пенициллиновых флаконах) с хорошо сформированным клеточным монослоем заменяют ростовую среду на поддерживающую с 1-2 % сыворотки крови эмбрионов крупного рогатого скота и добавлением антибиотиков: пенициллина в дозе до 1 000 МЕ/мл и стрептомицина в дозе до 200 мкг/мл. При культивировании клеток в инкубаторе без содержания СО₂, рекомендуется для стабилизации рН в синтетические среды добавлять Hepes (25 мм).

Маркируют пробирки (по 2 на каждую исследуемую пробу), вносят в каждую по 0,1 мл элюата и помещают в термостат (36,5-37,0 °С). Для контроля оставляют по несколько пробирок с незараженной культурой (со сменой и без смены среды).

Инкубируют зараженные клетки в течение 5 суток, микроскопируя их ежедневно для контроля начала цитопатического действия. При первых признаках деградации культуры (но не позднее 5-х суток), пробирки извлекают из термостата, удаляют из них культуральную среду и промывают физраствором (или раствором Хенкса). После промывки тщательно (пипеткой) удаляют из пробирок остатки промывной жидкости.

Перед началом процедуры выделения РНК пробирки с культурой ткани, освобождённой от промывной жидкости, трижды подвергают замораживанию при -20 °С и размораживанию при 37 °С, что обеспечивает выход энтеровирусов из клеток культуры, после чего переходят к выделению РНК.

8.6.2. Выделение РНК

Выделение РНК можно осуществлять с использованием стандартных наборов в соответствии с инструкцией производителя, например, типа «Рибозоль», «Рибосорб» и др. РНК можно хранить в течение 1 месяца в изопропаноле при -20 °С. Для длительного хранения к раствору РНК добавляют два объема 70 % этанола и помещают для хранения в морозильную камеру (при -70 °С).

8.6.3. Обратная транскрипция

8.6.3.1. Праймерные последовательности.

Праймерные последовательности можно синтезировать под заказ в организациях-производителях. Для постановки ИКК-ПЦР необходимо специально синтезировать 1 энтеровирусспецифический праймер, используемый на стадии обратной транскрипции (последовательность указана в табл. 3).

Таблица 3

На каком этапе используется	Название	Последовательность
Обратная транскрипция	НП1 (прямой)	5'-cgcctgttttataccccctcccccaa-3'

Праймеры, необходимые для проведения ПЦР, входят в состав готовой стандартной тест-системы.

8.6.3.2. Расчет рабочих концентраций праймеров.

Поставку праймеров производителем осуществляют в количествах, измеряющихся в оптических единицах (ОЕ) на мл. Для расчета рабочих концентраций праймеров необходимо перевести ОЕ в мкМ. Для праймера, длиной А пар нуклеотидов (п.н.), поставляемом в количестве В ОЕ, пересчет осуществляют следующим образом:

• определяют молекулярную массу (ММ) одноцепочечной ДНК (оцДНК) по формуле

ММ = 330 дальтон (ММ 1 п.н.) × А;

• определяют концентрацию праймера, исходя из того, что 1 ОЕ оцДНК соответствует концентрации 37 мкг/мл, соответственно В ОЕ соответствуют концентрации 37 × В мкг/мл;

• определяют концентрацию праймера С в мкМ

С = (37 × В × 1000) / (330 × А) (мкМ).

Ряд организаций-производителей обратной транскриптазы в инструкциях по постановке реакции обратной транскрипции указывают не концентрацию праймеров в мкМ, а количество праймера, добавляемое в реакцию (в pmol). В этом случае пересчет ОЕ в pmol следует производить по формуле

D = B /(0,01 × А), где

D - количество праймера (в pmol), содержащееся в 1 мкл раствора.

8.6.3.3. Постановка реакции обратной транскрипции.

Для обратной транскрипции можно использовать готовые стандартные наборы реагентов, разрешенные к применению для этих целей в Российской Федерации в установленном порядке. В состав наборов входят буферный раствор и фермент - обратная транскриптаза (ревертаза) различного происхождения. Ингибитор РНКаз и смесь ДНТФ некоторые производители поставляют отдельно. Все компоненты реакционной смеси для обратной транскрипции можно приобретать по отдельности.

Постановка:

• в 0,2 мл (или 0,5 мл) пробирки вносят: 10,0-14,5 мкл РНК пробы, 10-20 pmol прямого праймера НП1;

• смесь аккуратно перемешивают, осаждают центрифугированием (5 с при 5 000 об./мин или с использованием вортекса) и помещают в термоциклер на 70 °С 10 мин;

• по истечении времени нагревания пробирки достают и помещают на лед;

• в пробы добавляют: 5х или 10х буфер для обратной транскрипции (конечная концентрация - 1х), 1 мкл ДНТФ (100-200 мкМ), обратную транскриптазу (100-200 ед.), ингибитор РНКаз (20 ед.). Общий объем реакционной смеси составляет 20 мкл. Объем реакционной смеси при необходимости доводят с помощью свободной от РНКаз воды;

• смесь перемешивают, осаждают центрифугированием и выдерживают при комнатной температуре 10-15 мин;

• пробирки помещают в термоциклер и выдерживают 50 мин при 37-42 °С (время и температуру, необходимые для работы фермента, указывают в инструкции производителя).

После синтеза кДНК на РНК матрице пробы используют для ПЦР-амплификации.

8.6.3.4. Полимеразная цепная реакция.

Амплификацию полученной в реакции обратной транскрипции кДНК осуществляют с использованием тест-системы для амплификации участка кДНК энтеровирусов длиной 207 п.н. (кат. № V-16-100-R0,5 или Кат. № V-16-100-R0,2) в соответствии с прилагаемой инструкцией.

8.6.4. Анализ амппифицированной ДНК, учет результатов

Для анализа амплифицированной ДНК используют разные методы, наиболее простым из которых является гель-электрофорез. Для постановки электрофореза можно использовать комплект стандартных реагентов для электрофореза в агарозном геле (кат. № К5-200) в соответствии с инструкцией производителя.

Учет результатов проводят визуально с помощью трансиллюминатора. При этом агарозный гель, либо достают из кюветы и помещают на стекло трансиллюминатора, либо используют емкости из УФ-проницаемых материалов.

При постановке ОТ-ПЦР для выявления в пробе «минус» цепи РНК энтеровирусов, положительные образцы должны содержать полосу ДНК размером 207 п.н. Размер полосы определяют по соотношению с положительным контролем и ДНК-маркером. Результаты можно документировать посредством фотографирования или видеосъемки геля с использованием ультрафиолетовых фильтров.

8.6.5. Интерпретация результатов, полученных с использованием культур тканей методом ОТ-ПЦР

Выявление негативной РНК («минус» цепи РНК) энтеровирусов в пробе исследуемой воды с помощью ОТ-ПЦР зараженных культур клеток свидетельствует о присутствии в ней инфекционных энтеровирусов и интерпретируется как положительный результат молекулярного теста на инфекционность энтеровирусов.