Культивирование и индикация вирусов.

Культивирования:

Ø Лабораторное животные

Ø Куриный эмбрион (8-10 дней)

Ø Клеточные структуры ткани – монослой однородных клеток фиксированный к стеклу, который растет и размножается на специальной питательной среде (199). Они могут быть первичными – из нормальных клеток (культура Фб), она может дать только первичные регенерации в пробирке; перевиваемая - готовится как правило из опухолевой клетки (Hela), может пассироваться в течении долгих лет; Попупрививаемая – из норамльных клеток пассируется 10-15 раз.

Индикация:

На эмбрионе:

Ø По реакции гемагглютинации (ГМА), склеивание эритроцитов под влиянием вируса.

Ø Реакция имуноферментативная (ИФА)

Ø РИФ

На клеточной культуре:

Ø По цитопатическому действию (ЦПД), которое проявляется в гибели, деструкции или образованию синтиция.

Ø По выявлению специфических вирусных включений. Могут находится в цитоплазме, ядре (вирус бешенства).

Ø Реакции имунофлюоресценции (РИФ)

Ø Реакция гемабсорбции

Ø По изменению цвета индикатора питательной среды (199) – цветная проба.

Ø Метод электронной микроскопии

На животных:

Ø По клинической симптоматике

Ø По специфическим изменением клеток

Ø По включениям методом РИФ

Диагностика:

Вирусоскопия - обнаружение непосредственно в материале или найти его антигены, включения.

Ø Электронная микроскопия

Ø РИФ

Ø ИФА

Ø Цитоскопически

Вирусологический – включает культивирование вирусов, обнаружение вируса, идентификация вируса.

Ø Серологичекий – парные сыворотки больного для обнаружения специфических противовирусных антител.

Генетические -  обнаружить в материале больного вирусные нуклеиновые кислоты.

Ø Метод гибридизации

Ø Метод полимеразной цепной реакцией ПЦР

тема: Физиология микроорганизмов.

Включает питание, дыхания, размножение бактерий.

Метаболизм.

Метаболизм микрообранизмов – совокупность всех биохимических процессов происходящих в клетке. Различают энергитичекий метаболизм 9катабализм) – реакции расщепления при которых выделяется энергия; конструктивный (анабализм) – процессы синтеза веществ из которых образуются основные структуры клетки, требует энергии. Оба типа метаболизма связаны между собой, происходят одновременно, деления на два типа условно. Для питания микроорганизмов требуется 4 главных элемента: углерод, кислород, водород, азот. Эти элементы являются основой органических веществ и составляют 95% клетки. Кроме этого требуются макроэлементы: сера, фосфор, калий,, магний, кальция и микроэлементы: натрий, железо, цинк, марганец, медь.

1. Аутотрофный (сомопитающийся)

Типы питания:	Источник углерода, азота	Источник энергии	примеры	Патогенны
Аутотрофный (широко распространены)	Неорганические соединения (соли)	Ø Окислительно-востановительные реации (хемоаутотрофы) Ø Свет (фотоаутотрофы)	Нитрофицирующие-, азотфиксирующие-, серо- бактерии	нет
Гетеротрофы     Сапрофиты – используют органические соед   Паратрофы (паразиты)	Органические соединения (глюкоза, спирты, аминокислоты)   Органические соединения мертвых субстратов   Органические соединения живых субстратов	Ø Окислительно-востановительные реации (хемоаутотрофы) Ø Свет (фотоаутотрофы)		есть
Ауксоторофы

А широко распростеронены для культивирования неорганические питательные среды. Для Г среды с легко усвояемыми белками.

Микроорганизмы неспособные синтезировать, конкретное в-во из органического соединения – ауксотрофы обитают в среде обитания конкретных факторов роста (аминокислоты, пуриновые основания, пиримидиновые основания, фосфолипиды, холестерин, витамины В, геммы) могут нуждаться в одном или нескольких факторов. Прототрофы могут сами синтезировать.

Транспорт питательных веществ в бактериальную клетку.

1. Пассивный – облегченная диффузия, в следствии разности концентрации питательных веществ, без затрата энергии. Отвечает за транспорт цитоплазматическая мембрана. Помогают ферменты, белки
2. Активный транспорт – перемещение в-в происходит ч/з цитоплазматическую мембрану, отвечают за перенос специальные белки мембраны и периплазмы. Этот путь требует энергии и у бактерий он является доминирующим.
3. Транспорт обусловленный фосфорилированием (транслокация) – используется для переноса углевода. Вначале на наружней мембране происходит транслокация группы, дальше транспортируемое в-во поступает ч/з ЦПМ и на внутренней стороне происходит отделение радикалов от субстрата. Эти превращения необратимы.

Выделение в-в из клетки.

В процессе жизнедеятельности бактериальная клетка выделяет многие в-ва:

1. БАВ (ферменты)
2. Токсины
3. Антибиотикоподобные вещества – бактериоцили

Они выделяются ч/з ЦПМ, содержат сигнальный пептид для прохождения, а при выходе пептид остается в мембране. Процесс выделение это не выброс шлаков, а механизм адаптации клетки к условиям внешней среды. Это определяет конкурентные свойства бактерий.

Ферменты бактерий.

Ферменты – специфические белковые катализаторы, которые присудствуют во всех живых клетках и за каждое превращение отвечает фермент.

Регуляторные, которые работают на уровне генома воспринимает все метаболические сигналы и изменяют каталитическую активность.

Эффекторные ферменты – определяют метаболизм в б/к можно выделить 6 класов этих ферментов:

1. Оксидоредуктазы – катализируют о-в реакции между субстратом (НАД, НАДФ, каталаза, ДГ);

2. Трансферазы – катализирует реакции переноса химических групп и одноуглеродных остатков;

3. Гидролазы – катализируют реакции гидролиза связей (протеиназа, липаза, гликозидаза);

4. Лиазы – катализирует реакции присоединения и обрыва групп по 2-м связям (альдолаза, фумаразы, декарбоксилазы, дезаминазы);

5. Изомеразы – катализируют реакции изомеризации (топаза);

6. Лигазы – катализируют реакции синтеза.

Синтез ферментов видоспецифичен, постоянен и поэтому набор ферментов у бактерий используется для их видовой идентификации. Ферменты которые синтезируются независимо от условий обитания клетки – конститутивные. Ферменты синтез которых зависит от определенного субстрата в среде обитания – индуцивельные.

Получение микробных ферментов важная отрасль промышленной микробиологии, широко используется в биотехнологии. Промышленная микробиология получает: амилазы, липазы… как лекарста, питательные добавки, пектиназы – для осветления соков, рибонуклеазы, ДНК-лагазы, полимеразы – в генной инженерии для моделирования нуклеиновых кислот.

Метаболизм.

Азот необходим для синтеза аминокислот, белков, пуриновых, пиримидиновых нуклеотидов, для витаминов. Использование неорганического азота происходит при ассимиляции под действием нитратредуктазы Б, дессимиляции – сопровождается выделением газообразных форм азота – под действием нитратредуктазы А, восстановлением нитратов в нитриты. Появление азота служит для идентификации бактерий. Способность разлагать определенные аминокислоты тоже как идентификационные тест.

Высоко молекулярные соединения неспособны проходит ч/з клеточную стенку поэтому утилизировать белковый азот могут бактерии которые выделяют экзоферменты протеазы они расщепляют белки до пептидаз, поэтому протеолитическая активность используется для оценки ферм активности.

При выращивании в лабораторных условиях для источника азота используют пептоны, или препараты неполно гидролиза белка, белковые гидролизаты (продукт первичного гидролиза белка) – рыбы, мяса (сухожилия, костная мука, фасции).

Фосфор основной его источник неорганические фосфаты, отдельные нуклеиновые кислоты.

Сера получается из цистеина, метионина, витаминов (биотин, тионин), глютатион. Это определяет о-в потенциал клетки. Утилизируется в форме сульфатов и при этом переводит окисленную форму в восстановленную под действием сульфатредуктазы – с образованием сероводорода. Обнаружение сероводорода тоже идентификационный тест.

Кислород включается в бактериальную клетку из молекулярного кислорода с помощью оксигеназ и опосредовано из воды, СО₂ в зависимости от потребности в молекулярно кислороде бактерии делят на 5 основных групп:

1. Облигатные аэробы – способны получать энергию только путем дыхания (псевдомонады, вибрионы, бруцеллы) имеют фермент супроксиддесмутазу, каталазу

2. Облигатные анаэробы – метаболизм происходит в отсутствии свободного кислорода т.к. кислород ля них токсичен.

3. Факультативные анаэробы – растут как в присутствии свободного кислорода так и в отсутствии т.к. могут переключатся с дыхания на брожение пероксидаза

4. Аэробтолерантные – способны расти в присутствии атмосферного кислорода, но не используют его в качестве источника энергии (молочно-кислые бактерии) супреоксид десмутаза, пероксидаза

5. Микроаэрофилы (капнофилы)– нуждаются в кислороде для получения энергии в маленьких количествах, но лучше растут в присудствии высокой концентрации СО₂ (гонококки, кампилобактерии, хеликобактери)

Катаболизм.

           Реализуется ч/з образование молекулы АТФ «разменной монеты», может превражатся в АДФ, АМФ. Эта неустойчивость позволяет выполнять функцию переноса химической энергии. Синтез у гетеротрофов осуществляется двумя способами:

1. Окислительное фосфолирирование – дыхания при котором происходит транспорт электрона по дыхательной цепи у эукариот в митохондриях, у прокариот в ЦПМ. Перенос происходит по стандартной схеме: Субстрат → НАД → флавопротеины → железосодержащие белки→хиноны→цитохромы (а,в,с)→конечный акцептор. Окислению могут подвергаться органические субстраты идет до СО₂ и воды. Если субстрат неорганическое в-во, то это сероводородное (железное) дыхание. В реакциях окисления работают дегидрогеназы. Аэробное дыхание используется у сапрофитов, патогенные для человека имеют это дыхание (псевдомонады, холерные вибрионы).
2. Субстратное фосфолирирование – брожение

Катаболизм углеводов.

           Способность утилизировать углеводы важный идентификационный признак. Базовый субстрат – Глюкоза она используется как при дыхании, так и при брожении. Протекает одинаково у аэробов и анаэробов. Пути превращения:

1. Гликолиз – доминирует у энтеробактерии, конечное превращение идет с образованием пирувата (фермет аелаза). Затем он полностью окиляется и превращается в СО₂ в цикле Кребса (ферменты дегидрогиназы)
2. Пептофосфатный путь – не имеет специального назначения (дополнительный)
3. Кето-дезокси-6-фосфо глюканатный путь (КДФК) – только у прокариот (бактерий). Не образуется млочной муравьиной кислот.

Катаболизм азот содержащих органических сединений.

           Происходит ч/з декарбоксилирования с образованием СО₂ и работают ферменты декарбоксилазы. Происходит за счет дезаминирования, конечные продукты аммиак, индол, триптофан. Происходит за счет периаминироания. Определение ферментов используется для идентификации.

Катаболизм жиров.

           Происходит ч/з гидролиз кислот до глицерина и свободных кислот. Далее окисление с образованием ацетил КоА → цикл Кребса.

Анаболизм.

           Углеродные соединения (сахара, аминогруппы) образуются в ходе синтеза продуктов окисления пирувата и ц. Кребса. Эти продукты используются для синтеза моно-, ди-, полисахоридов. Синтез происходит на рибосомах в сочетании в мРНК ДНК-азы, РНК-азы идет синтез моносахарав, жирных кислот полимеров белков лигазы, синтетазы, пептидазы.

Взаимосзясь метаболизма и катаболизма самая прямая разграничение условное. Между ними гибкий баланс, главный метаболит пируват.

РОСТ И РАЗМНОЖЕНИЕ БАКТЕРИЙ

Рост- увеличение массы клеток, размножение – увеличение чила популяции клетки. Если бактерии культивируются в жидкой питательной среде то в процессе роста и размножения выделяют несколько фаз:

1. Начальная фаза (ЛАГ) – 2 часа, клетка увеличивается гтовится к делению. В этой фазе увеличивается количесвто рибосом.
2. Экспотенциальная (ЛОК) – скорость деления максимальная, в эту фазу максимальная чуствительность к антифиотикам.
3. Стационарная – постоянное количество микробных клеток
4. Отмирание – гибель клеток и накопление кислых продуктов метаболизма в питательной среде

 

Факторы влияющие на рост и размножение:

1. Культуральная среда – должны иметь определенный pH, стерильны, содержать углерод, азот, фосфор (5:1:0,3)
2. Температура – по этому микробы мезофильные (20-40⁰), термофилы (47⁰), сихрофилы (0 - +10)
3. Аэрация – присутствие свободного кислорода или его отсутствие
4. Концентрация ионов Н – большинство растут при 7,2, а некотрые растут в щелочной среде 8 (холерный вибрион), а некоторые килую (лактобактери). Поддержание рН необходимо для бактерий образующих кислые продукты. Для поддержания рН добавляют бикарбонаты, фосфаты.

           Экология микроорганизмов. Микрофлора воды, воздуха, почвы.

           Микробные биоценозы, влияние на бактерии физических факторов.

           На Земле микробы живут практически во всех регионах, климатических зонах и т.д. Обнаружены следы микроорганизмов в космосе.

Факторы влияющие на микроорганизмы:

Температура: по этой характеристики делятся на психрофилы (от-10 до +10), микробы лучше переносят низкие температуры; мезофиллы (от +20 до +40) практически все паразитические симбиоитные бактерии, человек для них идеальная питательная среды; термофилы (от +50 до +70).

Температурный минимум – температура при которой микроб замедляет жизнедеятельность.

Температурный максимум – температура при которой жизнедеятельность прекращает.

Температурный оптимум – оптимальная среда для микроба.

           В природе микробы размножаются только в воде и почве. Стоки воды большого города имеют бактерии которые разлагают вредные вещества и создают для патогенных бактерий неприемлемые условие происходит самоочищение.

Ø Антагонизм – одному из организмов причиняется вред. Возможно, что один вид размножается быстрее и другому не хватает питания. Возможно выделение одним микробов продуктов обмена, которые изменяют характеристики среды и другой не может развиваться. Выделение антибиотиков.

Ø Симбиоз – любое совместное проживание макро и микроорганизмов. Классическим симбиозом является мутуализм при этом два организма извлекают пользу. Метабиоз – продукт жизнедеятельности одного микроба, питательная среда другого, разновидность сателитизм – один микроб выделяет продукты, которые стимулирует рост другого микроба. Синергизм – повышается жизнеспособность под действием в-в выделяемых другими бактериями. Комменсализм – один из членов микробиоза извлекая питание из другого не нанося ему вреда.

Ø Хищничество

Ø Паразитизм

Типы заболевания в зависимости от источника:

Антропонозные – источник человек

Зоонозные, зооантропонозные – источник животные

Сапронозные – источник сама окружающая среда. Долгое время холерный вибрион считался антропонозом, но недавно было выявлено что он сапрофит.

           Но для большинства организмов окружающая среда прожиточный этап. Поэтому необходима оценка окружающей среды.

Методы оценки микробиологической чистоты объектов окружающей среды:

1. Прямые – подразумевают нахождение на объектах внешней среды патогенных микроорганизмов.

2. Косвенные – выявление санитарно-показательных микроорганизмов, они должны указывать возможность загрязнения и легко культивируются. Это микроорганизмы выделяются из организма человека.

Санитарная чистота воздуха.

СПМ: золотистый стафилококк, гемолитический стрептококк, споры плесневых грибов. Определяют общее микробное число – кол-во бактерий на 1м³, число стафилококков, стрептококков, грибов по отдельности.

Классы чистоты медицинских помещений:

А) Повышенной чистоты – операционные, родильные блоки, боксы для ожоговых.

Б) чистые – процедурные, перевязочные

В) условно чистые - палаты

Г) грязные – коридоры, туалеты, кабинеты

Методы определения чистоты воздуха:

Для общего числа – МПБ, для стафилококка – желточный агар, для стрептококков – кровяной агар, грибы – среда собурон.

Методы забора воздуха:

1)седиментация по Коху – открыть 2 чашки с питательной средой, ставить в термостат, на следующий день =считают 250 и менее чистые, 250-500 условно чистые, 500 и более грязные

2) 2 чашки открыть на 5 минут→термостат→подсчет по формуле Омелянского: за это время оседает столько микробов сколько содержится в столбе воздуха.

3) аспирационный метод – аппаратом Кротова. В аппарат помещается чашка с средой, над чашкой проходит поток воздуха и происходит посев. Зная скорость потока, время экспозиции и количество колоний можно подсчитать общее число микробов.

Санитарная чистота воды.

СПМ: общие колиформные бактерии ферментирующие лактозу при 37⁰, термолтолирантные ферментирующие бактерии при 40⁰. В 100 = 0 бактерий, колибактериофаги они указывают на вирусное загрязнение в 100 мл=0. Общее микробное число – число бактерий образующих колонии в 1 мл среды=50 КОЕ, споры сульфит продуцирующих бактерий, лямблии 50л=0, энтреробактерии.

Среды для колиформных бактерий: среда Эйтмана, Энда.

Методы определения колиформных бактерий:

1) бродильный – берут 333 мл (6 пробах) воды засевают в глюкозопептонную среду, затем заселяют колонии на среду, красят, делают оксидазный тест. Колитиртр объем воды в котором обнаружена 1 кишечная палочка, колииндекс – количество палочек на 1 литр.

2) Мембранных фильтров: через них пропускают воду, выкладывают на среду Энда если они присутствуют, то они берутся→красятся→считаются→окидазный тест→высевают →считают.