Вопрос 30 Анаэробные процессы: спиртовое, молочнокислое брожение. Возбудители, условия, химизм.

Брожение - процесс превращения соединений углерода как в анаэробных, так и аэробных условиях. Спиртовое брожение. Спиртовое брожение - это процесс превращения в анаэробных условиях сахара в диоксид углерода и этиловый спирт: С₆Н₁₂О₆ → 2СО₂ + 2С₂Н₅ОН. Этиловый спирт - один из широко распространенных продуктов сбраживания сахаров микроорганизмами. Даже растения и грибы в анаэробных условиях накапливают этиловый спирт. Химизм спиртового брожения. Возбудителями спиртового брожения являются дрожжи, которые выращивают в аэробных условиях, подбирая соответствующие расы, обладающие необходимыми свойствами для данного производства. Процесс спиртового брожения осуществляется с тем же запасом энергии в форме АТФ и тем же ферментативным путем, что и гликолиз, вплоть до образования пировиноградной кислоты. Превращение пировиноградной кислоты в этиловый спирт происходит в два этапа. Сначала пируват (пировиноградная кислота) декарбоксилируется пируватдекарбоксилазой при участии тиаминпирофосфата до ацетальдегида, а затем ацетальдегид восстанавливается алкогольдегидрогеназой в этанол при участии NADH₂ . При этом дрожжи получают энергию для развития биохимических процессов в клетке: глюкоза → этиловый спирт + СО₂ + 166 кДж/моль. С энергетической точки зрения брожение - процесс малоэффективный. Так, если при окислении 1 граммолекулы глюкозы до СО₂ и Н₂О в процессе аэробного дыхания синтезируется 36 моль АТФ, то в процессе спиртового брожения - всего 2 моль АТФ. Дрожжи могут переключать один тип обмена веществ (аэробный) на другой (анаэробный). Наряду с основными продуктами брожения - этиловым спиртом и СО₂ - образуются побочные продукты: глицерин, уксусный альдегид, уксусная кислота, янтарная кислота, сивушные масла. Высшие спирты участвуют в формировании аромата и вкуса напитков спиртового брожения. Дрожжи способны сбраживать помимо глюкозы и пировиноградную кислоту. В качестве промежуточного продукта при сбраживании пировиноградной кислоты образуется ацетальдегид; если к дрожжам, сбраживающим глюкозу, добавить бисульфит, то появится новый продукт - глицерин, однако при этом снижается выход этилового спирта и СО₂. Брожение в присутствии бисульфита стали использовать в промышленности при производстве глицерина.

На условия спиртового брожения влияют многие факторы: химический состав сбраживаемой среды, т. е. ее полноценность, концентрация и кислотность среды, содержание спирта, температура, наличие посторонних микроорганизмов. Большинство дрожжей способны сбраживать моносахариды, а из дисахаридов - сахарозу и мальтозу. Пентозы сбраживаются только некоторыми дрожжами. Дрожжи не могут сбраживать крахмал, так как они не образуют амилолитических ферментов. Наиболее благоприятная концентрация сахара в среде для большинства дрожжей составляет 10... 15%. При повышении концентрации сахара энергия брожения снижается, а при 30...35% сахара брожение обычно прекращается. Энергией брожения называется способность определенного количества дрожжей сбраживать за определенный промежуток времени то или иное количество сахара. В природе встречаются дрожжи, способные вызывать брожение сахара даже при концентрации его 50...60% и выше.

Хорошим источником азота для большинства дрожжей являются аммонийные соли, но дрожжи могут использовать также аминокислоты и пептиды. Брожение обычно протекает в кислой среде при рН 4... 5. В щелочной среде в результате брожения образуется глицерин. Наибольшая скорость брожения наблюдается при температуре около 30 °С; при температуре 45... 50 °С брожение прекращается в результате гибели клеток дрожжей. Снижение температуры приводит к замедлению брожения, но полностью оно не прекращается даже при температуре ниже О °С. Этиловый спирт, образующийся в процессе брожения, неблагоприятно влияет на дрожжи. Накопление дрожжами спирта в концентрации 2... 5 % в зависимости от вида и расы дрожжей действует на них уже угнетающе. В большинстве случаев брожение прекращается при накоплении дрожжами 12...14% (объемных) спирта. Выведены селекционерами расы дрожжей, устойчивые к накоплению 16... 18 и даже 20 % спирта.

Использование спиртового брожения лежит в основе производства этилового спирта, пива, вина и пекарских дрожжей.

Молочнокислое брожение. Молочнокислое брожение - это процесс превращения молочнокислыми бактериями сахара в молочную кислоту в анаэробных условиях. Молочнокислые бактерии обычно находятся в молоке и молочных продуктах, на растениях, в кишечнике человека и животных однако они не встречаются в воде и почве.

По конечным продуктам брожения молочнокислые бактерии подразделяют на две группы: гомоферментативные и гетероферментативные. В связи с этим существуют два вида молочнокислого брожения: гомоферментативное и гетероферментативное.

Гомоферментативное молочнокислое брожение широко применяют при изготовлении простокваш, кумыса, сквашивании сливок, получении молочной кислоты, при квашении овощей и силосовании корма.

При гомоферментативном молочнокислом брожении происходит расщепление глюкозы с образованием двух молекул молочной кислоты: Глюкоза → 2 молекулы молочной кислоты +197 кДж/моль. Молочная кислота - конечный продукта гомоферментативного брожения - образуется из пировиноградной кислоты: Пировиноградная кислота + 2Н₂ → молочная кислота. Если количество образуемой кислоты достаточно и рН достигает 4,6, происходит свертывание казеина, т.е. по мере накопления молочной кислоты плотность сгустка увеличивается.

Возбудителями гомоферментативного молочнокислого брожения являются бактерии, разные по форме (шаровидные и палочковидные) и свойствам (мезофильные и термофильные). Например, мезофильные молочнокислые бактерии имеют оптимальную температуру роста 25...35°С, а термофильные - 40...45°С. Отдельные молочнокислые бактерии холодоустойчивы и могут развиваться при температуре 5 °С и ниже. При нагревании до 60... 80 °С они гибнут в течение 10...30 мин, однако есть и термоустойчивые бактерии, не погибающие при нагревании до 85 °С в течение нескольких минут. Некоторые молочнокислые бактерии образуют слизь, при их развитии жидкие субстраты становятся тягучими. На расположение клеток бактерий влияют температура и продукты их жизнедеятельности. Например, молодые культуры, мы ращенные при оптимальной и более низкой температуре, представлены стрептококками, более старые культуры, выращенные при температуре выше оптимальной, представлены диплококками и кокками. Ниже приводится характеристика различных гомоферментативиых молочнокислых бактерий. Типичным представителем молочнокислых бактерий гомоферментативного молочнокислого брожения является молочнокислый стрептококк - Streptococcus (в дальнейшем Sir.) lactis, который находится почти во всех молочных продуктах, играет важную роль в сквашивании молока и является основной составной частью микрофлоры простокваш. Чаще всего он встречается в виде коротких цепочек и диплококков.

Sir. lactis является факультативным анаэробом, имеет овальную форму клетки, окрашивается по Грамму положительно, спор и капсул не образует, имеет оптимальную температуру роста 30... 35 °С. Через 10... 12 ч под действием молочнокислого стрептококка в молоке накапливается около 0,8... 1 % молочной кислоты, и молоко свертывается. Кислотность казеинового сгустка по Тернеру составляет 120 °Т. Молочнокислый стрептококк обладает антимикробным действием, образует полипептидные антибиотики - низины, устойчивые к высокой температуре и задерживающие рост многих грамположительных микробов, в том числе и патогенных (Mycobadterium tuberculosis). Низины применяют в пищевой промышленности. Сливочный стрептококк (Sir. cremoris) представляет собой длинные цепочки сферических клеток. Оптимальная температура роста 25°С, минимальная - до 10°С, максимальная - 36...38°С. Используется в заквасках вместе с молочнокислым стрептококком для изготовления сметаны, масла, сыров. Некоторые штаммы образуют антибиотик диплококцин.

Термофильный стрептококк (Str. thermophilus) образует длинные цепочки кокков, хорошо развивается при температуре 40... 45 °С. Образует около 1 % молочной кислоты. Используется вместе с другими палочковидными бактериями для получения ряженки, варенца, простокваши «Южная». Болгарская палочка (Lactobact. bulgariucus) представляет собой крупные палочки, часто образующие длинные цепочки. Оптимальная температура роста 40... 45 °С, минимальная - 15... 20 °С. Является активным кислотообразователем, образующим в молоке 2,5...3,5% молочной кислоты. Используется при изготовлении простокваши «Южная», кумыса. Является антагонистом гнилостной микрофлоры. Для уменьшения гнилостной микрофлоры необходимо систематическое поступление болгарской палочки в организм. Ацидофильная палочка (Lactobact. acidophilus) является постоянным обитателем желудочно-кишечного тракта молодняка сельскохозяйственных животных, откуда она и выделяется. Впервые она была обнаружена в фекалиях ребенка. Оптимальная температура роста 37...40°С, минимальная - около 20°С. При сквашивании в молоке накапливается до 2,2 % молочной кислоты. Некоторые виды обладают способностью образовывать слизь. Используется в производстве ацидофильных кисломолочных продуктов, образует антибиотические вещества, нейтрализует ядовитые продукты жизнедеятельности гнилостных микроорганизмов.

Дельбрюковская палочка (Lactobact. delbrueckii) - зерновая термофильная палочка, которая встречается в виде одиночных клеток или клеток, соединенных в короткие и длинные цепочки. В молоке не развивается, так как не может сбраживать лактозу. Оптимальная температура роста 45... 50 °С, минимальная - до 20 °С. Образует до 2,5 % молочной кислоты. Используется в хлебопечении и в производстве молочной кислоты. Молочнокислая палочка (Lactobact. plantarum) - палочковидные небольшие одиночные клетки, сцепленные попарно или цепочкой. Оптимальная температура роста составляет 30°С. При сквашивании молока образуется до 1,3 % молочной кислоты. Молочнокислая палочка является основным возбудителем брожения при квашении овощей и силосовании кормов.

Гетероферментативное молочнокислое брожение осуществляют гетероферментативные молочнокислые бактерии, которые кроме молочной кислоты образуют этиловый спирт, СО₂, уксусную кислоту, ацетоин и диацетил. К гетероферментативным молочнокислым бактериям относятся гетероферментативные молочнокислые стрептококки, характеристика которых приведена ниже. Ароматобразующие (Str. citrovorus, Str. diacetilactis, Lactobact. brevis) придают кисломолочным продуктам приятные вкус и аромат. Для приготовления кисломолочных продуктов ароматобразующие стрептококки соединяют с гомоферментативными - молочнокислым и сливочным. Они имеют почти одинаковую температуру роста (30 °С). Среди гетероферментативных молочнокислых бактерий есть и термофилы - Str. thermophilus, которые размножаются при температуре 45 °С, что позволяет использовать их с термофильными молочнокислыми палочками при производстве простокваши и таких сыров, как «Советский» и «Швейцарский». К гетероферментативным молочнокислым стрептококкам относится род Leiconostoc. Бактерии, относящиеся к этому роду, представляют собой удлиненные кокки, которые могут быть одиночными, парными, в виде коротких цепочек. При брожении они образуют диацетил. Оптимальная температура роста 20...25°С. Лейконосток вводят в закваски для ароматизации продукта. Некоторые виды Leuconostoc являются активными слизеобразователями, образующими много «клейкого» полисахарида декстрина густой слизистой консистенции.

К группе гетерофементативных молочнокислых бактерий относится род Bifidobacterium. Палочковидные формы вида Bifldobacterium bifidum (лат. bifidus - раздвоенный) содержатся в период молочного вскармливания в желудочно-кишечном тракте детей и молодняка сельскохозяйственных животных. Бифидобактерии при сбраживании углеводов образуют молочную и уксусную кислоты - биологически активные вещества, которые подавляют гнилостные и патогенные микроорганизмы. Все они строгие анаэробы. В настоящее время их обнаруживают в кишечной флоре и взрослых людей.