Раздел 2. Биообъекты в производстве лекарственных,профилактических и диагностических препаратов.

Совершенствование биообъектов.

Тема: Совершенствование     биообъектов      методами клеточной и     генетической        инженерии.

Иммобилизованные биообъекты.

Задача 7.

Существуют вполне определенные требования и условия для создания и развития биотехнологического производства ЛС. В частности, это касается проблемы выбора биообъектов для масштабирования производства. Имеются существенные различия между диким штаммом и промышленным штаммом. Штамм обладает вполне конкретными свойствами природного характера, а производственный процесс имеет свои требования к этому штамму. Существуют способы воздействия на дикий штамм с целью удовлетворения требований производства ЛС.

Проанализируйте данную ситуацию с точки зрения:

· представления о биообъекте и его функциях;

· соответствия свойств продуцента требованиям производства ЛС и проблем безопасности при работе с продуцентами;

· применения конкретных методов преобразования биообъекта для дальнейшего использования его в создании новых продуцентов ЛС.

Основным инструментом получения или модификации ЛС является биообъект. Именно поэтому - это продуцент, биосинтезирующий нужный продукт, либо фермент, катализирующий присущую ему реакцию. Для использования активно функционирующего биообъекта необходимо знать его свойства с целью его совершенствования.

Все биообъекты можно подразделить на: 

макрообъекты (человек, млекопитающие, рептилии, рыбы, насекомые, растения);

микрообъекты (эукариоты - низшие грибы, водоросли, кроме нитчатых;

прокариоты- актиномицеты,- бактерии, сине-зеленые водоросли); 

микробиосистемы (ферменты, протопласты).

Выбор биообъекта зависит от его конкретных свойств, таких, как безвредность, устойчивость к фагам и вирусам, активность биосинтеза, скорость роста и накопление биомассы, стабильность по производительности, чувствительность к условиям культивирования (аэрация, рН, температура), потребность в источниках углеводов и азота, использование дешевых и доступных питательных сред, соответствие условиям промышленного производства (отсутствие неприятного запаха, невысокая вязкость среды). Повышение биосинтетической активности биообъекта возможно прежде всего благодаря использованию методов мутагенеза и селекции. Методы современной селекции сочетаются с применением генной инженерии, которая манипулирует ДНК, изменяя либо число и порядок расположения генов, либо проводя внутригенные изменения. Важной характеристикой мутантов является их способность к реверсии (обратноемутирование). Типы мутаций: делеция, дупликация, амплификация и др. Проблема безопасности в работе с продуцентами на физическом уровне предполагает понижение давления внутри ферментера для предотвращения возможного выброса культуральной жидкости во внешнюю среду. На биологическом уровне это прежде всего неукоснительное соблюдение правил GMP, одновременно можно, например, сделать биообъект «капризным» в отношении компонентов питательной среды, тогда во внешней среде без них он существовать не сможет.

Задача 8.

Как известно, при использовании клеточной инженерии при создании новых продуцентов широко применяют методику прото-пластирования (получения протопластов) как процесс конструкции гибридных структур.

В плане решения задачи получения новых продуцентов как источников новых ЛС предложите:

· схему получения протопластов и гибридных структур;

· условия сохранения протопластов;

· конечные цели, достигаемые с помощью продуктов гибридной природы.

Для получения гибридных клеток применяют технику протопластирования, которая включает следующие этапы: 

выбор биообъектов (прокариот, эукариот);

- обработку клеточных стенок ферментами;

- стабилизацию протопластов (10% гипертонический раствор аннита, сахарозы, хлорида натрия);- слияние протопластов в среде ПЭГ;

для облегчения фузии клетки обрабатывают солями металлов,- ферментами или быстро меняют температуру, т.е. делают их компетентными;

 при слиянии (фузии) получается протопласт с двумя наборами хромосом - диплоидный набор (рекомбинация ДНК);

 регенерацию (восстановление стенки протопласта).

 Полученный гибрид засевают на плотную питательную среду. Чтобы отличить гибридную клетку от негибридной, необходимо на 4-й стадии включить еще один протопласт, несущий маркер. Маркер - это участок гена, кодирующий образование какого-либо фермента, который «заявляет» о себе при высеве на питательную среду, например маркер β-лактамаза. Если в питательной среде находится бензилпе-нициллин, то вырастут только клетки, содержащие β-лактамазу, а это могут быть только клетки-гибриды. При протопластировании и слиянии протопластов может происходить явление амплификации (увеличения) количества генов. Например, если амплифицируется ген, ответственный за синтез целевого продукта, то выход последнего (витамины, гормоны, антибиотики) соответственно увеличивается.

Задача 9.

В современной биотехнологии при создании ЛС особое место отводится генной инженерии, суть технологии которой заключается в искусственном соединении отдельных фрагментов ДНК invitro с последующим введением изолированной ДНК в живую клетку с целью получения рекомбинантных белков. Для осуществления этого необходимы определенные условия, наличие транспортного устройства для внесения ДНК в клетку продуцента, использование ферментов для включения нового гена. Генная инженерия оперирует такими понятиями, как вектор, рестриктазы, липкие концы, сайт узнавания, лигазы, ген-маркер, компетентность клетки, экзон, интрон.

С представленных общих позиций по генной инженерии сформулируйте конкретные условия:

—расшифруйте понятие «вектор» и пути его введения в клетку; предложите ферменты, работающие в этой ситуации;

—предложите технику генно-инженерного эксперимента (стадии);

—сравните процесс образования мРНКу эукариот и прокариот.

Цели генной инженерии - создание новых продуцентов целевых продуктов (новые ЛС, диагностические и профилактические препараты). Суть технологии - соединение фрагментов ДНК invitro с последующим введением изолированной ДНК в живую клетку посредством ферментов эндонуклеаз, в частности рестриктаз. Техника генно-инженерного эксперимента 

Получение чужеродного фрагмента ДНК для последующей вставки его в клетку хозяина.

- Выделение плазмиды из клетки-донора (например, Е. соli).

- Конструирование рекомбинантной плазмиды (вектора).

Векторрекомбинант (плазмида в виде фага- или изолированной ДНК, или вируса) получают с помощью фермента рестриктазы, рарезающей фосфодиэфирные связи в строго определенном месте последовательности оснований нуклеотидной цепи (сайт узнавания). При этом образуется два липких конца. Далее следует стадия отжига - процесс смещения двух фрагментов ДНК, при котором восстанавливаются только водородные связи. Для восстановления фосфодиэфирных связей используют ферменты ДНК-лигазы, которые «сшивают, склеивают» молекулы ДНК. 

Включение вектора в клетку хозяина. Вектор включается в клетку хозяина при условии, если- цитоплазматическая мембрана близко подходит к клеточной стенке, тогда вектор проникает внутрь клетки через так называемые окошечки, которые образуются при обработке ее ферментами, в результате чего эта клетка становится компетентной. 

Отбор гибридных клонов. Проводят посев на питательную среду, содержащую, например,- антибиотик бензилпенициллин. При этом вырастают только клоны, имеющие в своем геноме генмаркер, кодирующий синтез, например, фермента β-лактамазы. Ген-маркер заранее внедряется в геном гибриднойплазмиды. В процессе образования молекулы мРНК имеет место процесс сплайсинга (сращивания). Уэукариот, в отличие от прокариот, ген представляет собой мозаичную структуру, содержащую наряду с экзонами (последовательности оснований, несущие информацию) интроны (последовательности оснований, не несущие информацию). Однако фермент РНК-полимераза катализирует транскрипцию как экзонов, так и интронов. В процессе сплайсингауэукариотинтроны с помощью ферментов вырезаются, а экзоны после удаления интронов сращиваются. При этом образуется функционирующая (зрелая) мРНК. Упрокариот нет такого процесса (так как их гены не содержат интроны), и образующаяся в результате транскрипции молекула мРНК сразу же способна к функционированию.

Задача 10.

Возникновение таких новых дисциплин, как геномика и протеомика, является настоящим прорывом в биологии и имеет большое значение при создании новых, более эффективных ЛС. Если геномика обозначает совокупность всех генов организма, то протеомика подразумевает совокупность всех каталитических и структурных белков в клетке эукариота или прокариота. Задача геномики - полная генетическая характеристика именно всей клетки. Геномика позволяет выразить сущность организма, его видовые и индивидуальные отличия, предвидеть реакцию на внешние воздействия. Геномика имеет свою классификацию, открывает новые возможности для генотерапии, создания нетрадиционных ЛС, таких, как антисмысловыеолигонуклеотиды.