Бактерии, участвующие в маслянокислом брожении

 

К клостридиям относят большое количество видов бактерий, число которых постоянно возрастает. Это один из самых крупных родов среди эубактерий. Принадлежность к роду определяется на основании только трех признаков:1)способности образовывать эндоспоры 2) облигатно анаэробного характера энергетического метаболизма 3) неспособности осуществлять диссимиляционное восстановление сульфата. Отсюда понятно, что эта группа эубактерий чрезвычайно гетерогенна, о чем, в частности, свидетельствует интервал значений ГЦ - оснований ДНК, молярное содержание которых с учетом описанных новых видов занимает область от 21 до 57%.

Из этого также можно сделать вывод, что организмы, объединенные в род Clostridium, нельзя рассматривать как эволюционно однотипные. Последующая характеристика их метаболических особенностей дает достаточно четкое представление об этом. Изучение эубактерий, относимых к клостридиям, наоборот, указывает на раннее расхождение видов рода в процессе эволюции. За исключением C. coccoides, вегетативные клетки бактерий из рода Clostridium имеют форму прямых или слегка изогнутых палочек с закругленными концами. Большинство видов грамположительные, подвижные. Движение осуществляется с помощью перитрихиально расположенных жгутиков. По мере старения в процессе цикла развития клетки теряют подвижность, накапливают гранулезу (запасное вещество типа крахмала) и переходят к спорообразованию. Образующиеся споры овальной или сферической формы. Диаметр их, как правило, превышает диаметр вегетативной клетки, поэтому, если, формирующаяся спора расположена в центре клетки, последние меняют форму, становясь веретеновидными; если же споры образуются у одного из клеточных концов, клетки приобретают форму барабанных палочек.

Клостридии - облигатные анаэробы. Однако спектр их чувствительности к молекулярному кислороду достаточно широк, что связано с обнаружением в клетках большинства клостридиев супероксиддисмутазы и с другими приспособлениями на уровне клеточных популяций, помогающими нейтрализовать токсические эффекты О₂ и его производных. Именно при работе с клостридиями Л. Пастер в 1961г. открыл форму жизни без кислорода (Емцев, Мишустин, 2006).

В зависимости от вида сбраживаемого субстрата выделяют несколько физиологических групп клостридиев: сахаролитические клостридии, использующие в качестве субстратов брожения вещества углеводной природы (моносахара, крахмал, клетчатка); протеолитические клостридии, субстратами брожения которых являются белки, пептиды, аминокислоты пуринолитические клостридии, специфически приспособленные к сбраживанию гетероциклических соединений (пурины и пиримидины). Среди них есть виды, обладающие довольно широкими возможностями (субстратами брожения служат как углеводы, так и белки), и узкоспециализированные виды, способные использовать в качестве источника энергии и углерода какое-либо или очень небольшое число соединений.

Субстратом брожения сахаролитических клостридий является такие моносахара, как глюкоза, фруктоза, ксилоза и др. Некоторые виды могут использовать крахмал, целлюлозу, пектин, хитин, предварительно гидролизуемые соответствующими экзоферментами. Типичными представителями сахаролитических клостридий, осуществляющих классическое маслянокислое брожение, являются C. butyricum и C. pasteurianum.

 

Таблица 1. Основные продукты брожения некоторых сахаролитических клостридий, не образующих масляной кислоты.

Организм	Основные продукты брожения
C. sphenoides, C. glycolicum	этанол, уксусная кислота, СО2, Н2
C. cellobioparum
	этанол, уксусная, муравьиная, молочная кислоты; СО2, Н2
	C. clostridioforme
этанол, муравьиная, уксусная, молочная кислоты; СО2, Н2
C. oroticum	этанол; уксусная, молочная, муравьиная кислоты; СО2
	C. coccoides
янтарная, уксусная кислоты
C durum	этанол, пропанол; муравьиная, уксусная, молочная кислоты
	C nexile
этанол; муравьиная, уксусная, молочная, янтарная кислоты; Н2
С. quercicolum	уксусная, пропионовая кислоты, Н2
	C. ramosum
муравьиная, уксусная, молочная, янтарная кислоты
C. aceticum, C. thermaceticum, C. formicaceticum, C. spiroforme	уксусная кислота

К протеолитическим относятся клостридии, имеющие активные протеолитические ферменты и поэтому способные использовать в качестве субстратов белки и пептиды, гидролизуя их до аминокислот и подвергая затем последние сбраживанию. В эту группу входят C. putrificum, C. histoliticum, C. sporogenes и другие сапрофитные виды. Близки к этим видам и некоторые патогенные формы: C. botulinum – продуцент ботулина – экзотоксина, являющегося одним из самых сильных биологических ядов; C. tetani – столбнячная палочка, образующая в организме человека столбнячный токсин. К протеолитическим клостридиям примыкают виды, использующие в качестве источника углерода и энергии ограниченное число свободных аминокислот. Например, C. cochlearium растет только на среде с глутаминовой кислотой, глутамином и гистидином; C. sticklandii может сбраживать лизин, аргинин, фенилаланин, серин, а C. propionicum – треонин, аланин, серин, цистеин.

С жизнедеятельностью клостридий связаны различные процессы, протекающие в природе: разложение (гниение) азотсодержащих соединений (белков, нуклеиновых кислот) в анаэробных условиях; анаэробное разложение растительных материалов, таких как клетчатка, хитин. Некоторые сахаролитические клостридии могут использовать в качестве субстрата брожения пектиновые вещества, составляющие покровы растительных клеток. Пектин — полимер метил-D-галактуроновой кислоты. Последняя имеет сложное строение и при воздействии на нее пектиновыми ферментами гидролизуется на ряд сахаров, кислот и метиловый спирт. Клостридии, принадлежащие к виду C felsineum, содержат активную пектиназу и могут, поэтому получать энергию, осуществляя маслянокислое брожение пектиновых веществ. Этот вид играет важную роль в процессе мацерации волокон при мочке льна.

Еще в конце прошлого века было обнаружено, что некоторые клостридии патогенны, т. е. вызывают заболевания человека и животных. В основе патогенности клостридиев лежит их способность синтезировать и выделять из клетки высокоэффективные токсины.

К возбудителям маслянокислого брожения относится в первую очередь вид Clostridium saccharobutyricum (Granulobacter saccharobutyricum). Клетки его цилиндрической формы, длиной от 4-5 до 7-12 мкм и толщиной от 0,5 до 1-1,5мкм, подвижные, спорообразующие. Перед образованием спор в них накапливается гранулеза. Спора появляется чаще в центре клетки, последняя возле споры расширяется (клостридий). Иногда спора располагается на конце клетки, форма которой приобретает вид ракетки (плектридий). Споры довольно устойчивые, они могут выносить непродолжительное кипячение в течение 1-2 мин.

Clostridium saccharobutyricum - облигатный анаэроб, с оптимальной температурой развития 30-40^оС, сбраживает многие углеводы и близкие к ним соединения с обильным выделением водорода и углекислоты при одновременном накоплении масляной кислоты. Последняя этими бактериями не потребляется. С.Н. Виноградским описан возбудитель маслянокислого брожения Clostridium pasteurianum, способный усваивать атмосферный азот. По многим признакам он сходен с предыдущим видом, но отличается от него биохимическими особенностям - он не сбраживает крахмал. К маслянокислым бактериям относится также вид Clostridium butyricum и некоторые другие представители. По отношению к источникам азота Маслянокислые бактерии весьма неприхотливы: они усваивают белковый, аминокислотный и аммонийный азот, а некоторые используют азот воздуха.

Маслянокислые бактерии являются также возбудителями ацетонобутилового брожения, анаэробного брожения клетчатки и брожения пектиновых веществ.

Ацетонобутиловое брожение представляет собой превращения углеводов бактериями с образованием ацетона и бутилового спирта. При этом брожении, кроме ацетона и бутилового спирта, вырабатываются также масляная и уксусная кислоты, водород и углекислый газ. Суммарно данное брожение можно выразить следующим уравнением:

12 С₆Н₁₂О₆ → СН₃СН₂СН₂СН₂ОН + 4СН₃СОСН₃ + СН₃СН₂ОН + СН₃СН₂СН₂СООН + 18Н₂ + 28СО₂ + 2Н₂О + Х кДж

Механизм ацетонобутилового брожения

Химизм ацетонобутилового брожения еще недостаточно выяснен. В последнее время для изучения его используют метод меченых атомов. В бродящую среду вводят промежуточные продукты брожения (уксусную, ацетоуксусную и масляную кислоты), содержащие углерод С¹³, а затем определяют наличие этого углерода в конечных продуктах. Этим способом установлено, что при добавлении уксусной кислоты с С₁₃ около 50% всего меченого углерода содержится в бутиловом спирте, около 15%- в ацетоне, до 18% - углекислом газе. При добавлении масляной кислоты, содержащей С₁₃, около 85% меченого углерода переходит в бутиловый спирт. Он найден также в этиловом спирте, в уксусной и масляной кислотах. Исходя из этих данных, считают, что образование бутилового спирта идет главным образом через масляную кислоту. Кроме того, полагают, что ацетон образуется через масляную кислоту.

В химизме ацетонобутилового брожения имеется много общего с маслянокислым, а частности, первые стадии до образования ацетольдоля протекают подобно маслянокислому брожению. Далее между двумя молекулами ацетальдоля протекает окислительно – восстановительная: оксимасляная кислота и оксибутиловый спирт по следующему уравнению: реакция, в результате которой образуются два соединения: β - оксимасляная кислота и β - оксибутиловый спирт по следующему уравнению:

 

2СН₃СНОСН₂СНО + Н₂О → СН₃СНОНСН₂СООН + СН₃СНОНСН₂СН₂ОН

β - Оксимасляная кислота далее отщепляет водород и переходит в ацетоуксусную кислоту, которая затем распадается на ацетон и углекислый газ:

 

СН₃СНОНСН₂СООН → СН₃СОСН₂СООН → СН₃СОСН₃ + СО_в –

 

оксибутиловый спирт подвергается восстановлению до n - бутилового спирта согласно уравнению:

 

CН₃СНОНСН₂СН₂ОН + Н₂ → СН₃СН₂СН₂СН₂ОН + Н₂О

 

Часть уксусного альдегида, по-видимому, также вовлекается в окислительно-восстановительную реакцию с образованием уксусной кислоты и этилового спирта:

 

СН₃СНО + СН₃СНО + Н₂О →СН₃СООН + СН₃СН₂ОН

 

В ацетонобутиловом брожении наблюдаются две фазы: первая - кислотная, во время которой усиленно размножаются бактерии, а в среде накапливаются масляная и уксусная кислоты, и вторая - ацетонобутиловая, в ней уменьшается кислотность и происходит усиленное накопление ацетона, бутилового и этилового спиртов. В зависимости от условий брожения, т. е. подавляя какую – либо фазу брожения, можно получить усиленное накопление тех или иных продуктов. Следовательно, ацетонобутиловое брожение отличается от маслянокислого: при маслянокислом брожении накапливающиеся кислоты постепенно замедляют процесс кислотообразования и даже останавливают его, а при ацетонобутиловом – образовавшиеся кислоты потребляются бактериями и превращаются в другие вещества.

Первый возбудитель ацетонобутилового брожения выделен в 1911 г. Бейеринком. Он получил название Granulobacter butyricum. Более активным возбудителем этого брожения явился вид Clostridium acetobutyricum. Клетки его по морфологическим признакам сходны с маслянокислыми бактериями. Это подвижные, грамположительные, палочки со спорами, развивающиеся в анаэробных условиях. Спорообразование - клостридиальное. В клетках накапливается гранулеза. По биохимическим свойствам данный вид сильно отличается от маслянокислых бактерий. Начиная с 1923 г. ацетонобутиловые бактерии используются в промышленных масштабах для получения ацетона и бутилового спирта из крахмалистого сырья и мелассы.

Среди возбудителей маслянокислого брожения встречаются такие культуры, которые способны вызывать брожение клетчатки. Способность анаэробных микроорганизмов разрушать клетчатку впервые была установлена в 1875г. Л. Поповым, а сущность этого процесса раскрыта в 1889- 1902 гг. В. Л. Омелянским, который выделил две разновидности целлюлозоразрушающих бактерий. Одна из них вызывает водородное брожение клетчатки Bac. cellulosae hydrogenicus,а вторая – метановое Bac. cellulosae metanicus. У этих бактерий морфологических различий почти не наблюдается. Молодые формы - необычайно тонкие, прямые, иногда слегка изогнутые палочки, толщиной от 0,3 до 0,5 мкм и длиной от 4 до 8 мкм. По мере развития палочки удлиняются и достигают 10-15 мкм, затем на их конце их образуются споры. При этом клетки приобретают форму барабанной палочки. Со временем спора в виде круглого тельца освобождается от клетки. Одним из существенных морфологических различий между водородными и метановыми бактериями является разная способность к спор к прорастанию. Споры возбудителя метанового брожения прорастают намного быстрее спор водородного брожения.

Химизм этого брожения сложен, так как целлюлозоразлагающие бактерии сначала переводят углеводы в растворимые сахара, которые затем частично сбраживают главным образом до масляной и уксусной кислот. Из других продуктов эти бактерии продуцируют спирт, муравьиную и молочную кислоты, а также выделяют газы - водород или метан (в зависимости от культуры) и углекислый газ.

При водородном брожении газообразные вещества - водород и углекислота - составляют примерно 1/3 массы разложившейся клетчатки. При метановом брожении газообразных веществ (метана, углекислоты) получается больше, они составляют примерно половину массы разложившейся клетчатки.

Возбудители водородного и метанового брожения наряду с клетчаткой способны сбраживать соли масляной, молочной, муравьиной и других кислот, накапливающиеся при брожении клетчатки. В результате такого процесса в анаэробных условиях достигается полная минерализация клетчатки - наиболее сложного и устойчивого полисахарида. В последнее время установлено, что возбудители маслянокислого брожения клетчатки являются активными продуцентами витамина В₁₂. Это свойство их используется для промышленного получения кормового витамина В₁₂.

Пектиновые вещества входят в состав тканей растений. Являясь составной частью клеточной оболочки, они как бы склеивают клетки между собой, образуя межклеточные пластинки. Они находятся в значительном количестве в некоторых органах растений, например, в листьях, в мякоти плодов, ягод, корнеплодов, в кожице цитрусовых и во многих других.

Пектиновые вещества в природе минерализуются микроорганизмами, обладающими ферментами протопектиназой (пектазой) и полигалактуроновой (пектиназой). Фермент протопектиназа расщепляет в пектине связи между метоксилированной полигалактуроновой кислотой и связанным с ней арабаном. Освободившаяся при этом метоксилированная полигалактуроновая кислота (растворимый пектин) под действием пектинэстеразы гидролизуется с образованием метилового спирта и полигалактуроновой кислоты.

Полигалактуроновая кислота подвергается также действию другого фермента - полигалактуроназы микроорганизмов (бактерий и плесневых грибов). Этот фермент гидролизует гликозидные связи между остатками галактуроновой кислоты, не содержащими метоксильных групп. Галактуроновые кислоты наряду с другими соединениями гидролизуются и используются микроорганизмами в качестве источника углерода. В результате гидролиза пектина образуются продукты: галактуроновая кислота, галактоза, арабиноза, ксилоза, уксусная кислота и метиловый спирт. Некоторые из них – моносахариды – используются этими же пектинразлагающими микроорганизмами, так арабиноза сбраживается ими до масляной кислоты и углекислоты, а из галактозы наряду с масляной и угольной кислотами выделяется водород (Емцев, Мишустин, 2006).

Среди пектинразлагающих микроорганизмов известны бактерии вида Clostridium pectinovorum, которые вызывают маслянокислое брожение пектиновых веществ (описаны Бейеринком в 1902 г.). Они представляют собой сравнительно крупные, подвижные, грамположительные палочки длиной 10-15 мкм и шириной 0,8 мкм. В клетках образуются споры, которые располагаются на утолщенных концах. Относятся эти бактерии к облигатным анаэробам. При сбраживании пектиновых веществ они накапливают масляную и уксусную кислоты, водород и углекислый газ. При соответствующих условиях брожения могут вырабатывать, кроме основных продуктов брожения, бутиловый спирт и ацетон.

Возбудителем пектинового брожения является также Clostridium felsineum. Микроорганизм выделен итальянским исследователем Карбонэ в 1916 г. из стеблей конопли. По форме клеток – споровая палочка одиночная или соединенная в короткие цепочки размерами 3/ 5 * 0,3 мкм. Споры располагаются на конце (барабанная палочка), но иногда бывают и в центре клетки. Культура обладает сравнительно высоким температурным оптимумом. Она сбраживает пектиновые вещества с образованием преимущественно уксусной кислоты и совершенно не продуцирует масляной.

Кроме описанных представителей, известны еще и некоторые другие, которые, разлагая пектиновые вещества, сбраживают продукты гидролиза (арабинозу, галактозу и др.) по типу маслянокислого или ацетонобутилового брожения.

Брожение пектиновых веществ нашло применение в хозяйственно-технической деятельности человека, в частности, для получения прядильных волокон из льна, конопли и других волокнистых растений путем мочки их в естественных водоемах.

Для ускорения и улучшения процесса освобождения волокон мочку сырья производят в бассейнах. При этом способе применяют специально выращенные культуры бактерий. Процесс ведут при температуре 26-28^оС в течение 5 суток вместо 1,5-2 недель в естественных водоемах.

Анаэробные бактерии рода Clostridium были открыты Л. Пастером в 1861 г. Ученый обнаружил, что некоторые представители данного рода сбраживают углеводы с образованием масляной кислоты. Сейчас среди представителей Clostridium насчитывается более 80 видов бактерий. Они имеют палочковидные клетки, обычно подвижны, передвигаются при помощи перитрихальных жгутиков. У видов рода образуются споры, имеющие овальную или сферическую форму; они терморезистентны. Как правило, споры раздувают клетку. Грамположительные. Облигатные анаэробы (Богданов и др., 1968).

Род включает психрофильные, мезофильные и термофильные виды. Температурный оптимум для роста большинства мезофильных видов лежит в диапазоне 30-40^оС. Для термофильных видов температурный оптимум составляет 60-75^оС. Оптимальная реакция среды для клостридий - нейтральная или слабощелочная. Хемоорганогетеротрофы. Клостридии сбраживают сахара, многоатомные спирты, аминокислоты, пурины и пиримидины, другие органические соединения. Ряд видов способен к фиксации молекулярного азота атмосферы. Места обитания клостридий - почва, водоемы, а также пищеварительный тракт человека и животных.

Все виды рода объединены в группы в зависимости от способности сбраживать те или иные органические соединения.

Первая группа - сахаролитические виды Clostridium, сбраживающие главным образом растворимые углеводы, крахмал или пектин с образованием бутирата, ацетата, СО₂ и Н₂. Брожение при участии некоторых микроорганизмов группы приводит к образованию из сахаров дополнительных нейтральных соединений (бутанола, пропанола, ацетона, небольших количеств этанола). В группу входят бактерии, вызывающие маслянокислое и ацетонобутиловое брожения: C.butyricum, C. pasteurianum, C. tyrobutyricum, C. butylicum, C acetobutyricum и др. Возможно, к ней можно отнести и ряд видов – высокоспециализированных агентов анаэробного разрушения целлюлозы, причем главные конечные продукты брожения - этанол, ацетат и сукцинат, СО₂ и Н₂.

Вторая группа - протеолитические виды, сбраживающие аминокислоты. Обладают сильными протеолитическими свойствами и способны к интенсивному гидролизу белков с последующим сбраживанием аминокислот. Рост микроорганизмов в средах с белком сопровождается образованием аммиака, СО₂, Н₂, жирных кислот, и большого количества летучих соединений с неприятным запахом. К группе относятся виды: C. sporogenes, C. perfringens, C. histoliticum, C. botulinum и др. Многие представители рода Clostridium, сбраживающие аминокислоты, способны также к сбраживанию углеводов.

Третья группа - виды сбраживающие азотсодержащие циклические соединения - пурины и пиримидины. Пурины (гуанин, гипоксантин, ксантин и др.) под влиянием C. acidi- urici, C. cylindrosporum превращаются в аммиак, ацетат и СО₂. C. uracilicum, C. oroticum сбраживают пиримидины, при этом урацил распадается до в- аланина, СО₂ и NН₃, а оротовая кислота- до уксусной кислоты, СО₂ и NН₃.

Четвертая группа включает всего один вид - C. kluyveri, сбраживающий смесь этанола с ацетатом до бутирата и капроновой кислоты, а также небольшого количества водорода.

Получение витамина В₁₂ с помощью пропионовокислых бактерий

В настоящее время для получения витамина В₁₂ используют следующие микроорганизмы Prop. freudenreichii ATCC 6207, Prop. shermanii ATCC 13673, Prop. shermanii BKM-103 и их варианты и мутанты. Наибольший интерес представляют разложение клетчатки.