Глава 2. Экспериментальная часть

 

Объект исследования

 

Материалом исследования послужили сеголетки карпа (Cyprinus Сarpio L.), достигшие 5 - 6 месяцев, весом 100 - 150 гр., отловленные в прудах Широкольского комбината Тарумовского района РД перед их переброской в пруды для зимовки. Рыбокомбинат занимает около 1,5 тыс. гектаров водной поверхности. Глубина прудов составляет примерно 1,5 - 2 м., они снабжаются пресной водой из р. Сулак.

Выбор объекта исследования связан с тем, что карповые обладают значительной устойчивостью к смене среды обитания, холоду и другим неблагоприятным условиям жизни. Рыбы были перевезены в специальных мешочках с кислородом из с. Юрковка Тарумовского района в г. Махачкала и помещены в аквариумы объемом 250 - 300 литров по 15 - 20 штук в каждом. В течение месяца они проходили адаптацию в условиях лаборатории.

 

Постановка эксперимента

 

Сеголетки карпа были распределены на три группы, которые содержались в разных аквариумах:

- контроль (интактные рыбы, которые содержались в чистой воде);

- опытная группа (в аквариумы добавляли раствор ацетата свинца расчета 0,5 мг/ дм3) (ПДК - 0,1 мг/дм3);

- опытная группа (в аквариумы добавляли раствор сульфат марганца из расчета 0,1 мг/ дм3) (ПДК - 0,01 мг/дм3) (Минина, 2003; Волошина, 2006).

В аквариумах создавались условия постоянного температурного (t 19-210C) и газового режима. Биохимические анализы проводили на 5, 15, 30 и 40 дни эксперимента по следующему показателю  динамика общих липидов и общего холестерина в сыворотке сеголеток карпа в норме и при хронической интоксикации ионами марганца и свинца.

 

2.2.1 Методика определения содержания общих липидов в сыворотке крови (Chromy et al., 1975)

Набор реактивов для приготовления 290 мл рабочего раствора для определения общих липидов в сыворотке крови. Объем достаточен для 180 анализов.

Принцип метода:

Ненасыщенные липиды и жирные кислоты, фосфолипиды и холестерин взаимодействуют после гидролиза серной кислоты с фосфованилиновым реактивом с образованием красного окрашивания.

Реактивы:

. Стандартный раствор (8 мл)

общие липиды 8 г/л

. Раствор ванилина (290 мл)

ванилин 10 ммоль/л, кислота ортофосфорная 11,5 моль/л

Состав реакционной смеси:

Ванилин 9,4 ммоль/л

Кислота ортофосфорная 10,8 ммоль/л

Кислота серная 1,1 моль/л

Соотношение сыворотка/реакционная смесь 1/1230

Референтные величины:

(нтБ) С - Общие липиды, (г / л) 4-8

Приведенный диапазон референтных значений является ориентировочным.

Воспроизводимость:

Около ± 5%

Вспомогательный раствор (не входит в состав набора)

Кислота серная конц., ч. д. а.

Проведение анализа:

Длина волны (510-550) нм

Кювета 1 см

Температура (+15 до +25)°С

В трех пробирках смешивают серную кислоту конц., ч. д. а. в соотношении 75+1 с сывороткой (проба), реактивом 1 (стандарт) или дистиллированной водой (контрольный раствор), перемещивают и нагревают 15 мин на кипящей водяной бане (напр.1,5 мл серной кислоты конц. ч. д. а. и 0,02 мл сыворотки, реактив 1 или дистиллированной воды). После охлаждения пробирок проточной водой смешивают гидролизат с реактивом 2 в объемном соотношении 1+15 и оставляют стоять 50 мин при температуре (с +15 до +25)°С (напр.0,1 мл гидролизата пробы, стандарта или контрольного раствора и 1,5 мл реактива 2). Не позднее чем через 60 мин измеряют оптическую плотность пробы (А1) и стандарта (А2) против контрольного раствора.

 

Отмерить (мл)	Проба	Стандарт	Контрольный раствор
Сыворотка Реактив 1 Кислота серная конц.	0,02 1,50	- 0,02 1,50	- 1,50
Перемешивают и нагревают 15 мин на кипящей водяной бане. После охлаждения пробирок проточной водой отмеряют
Гидролизат Реактив 2	0,10 1,50	0,10 1,50	0,10 1,50
Перемешивают и оставляют стоять 50 мин при (+15 до +25)°С. Не позднее чем через 60 мин измеряют оптическую плотность пробы (А1) и стандарта (А2) против контрольного раствора

 

Расчет:

Общие липиды (г/л) = 8 × А1/А2

 

2.2.2 Методика определения содержания общего холестерина в сыворотке крови (Fishbach, Dunning, 2004)

Набор реагентов для определения концентрации общего холестерина в сыворотке и плазме крови энзиматическим колориметрическим методом.

Принцип метода:

Холестерин из состава эфиров высвобождается под действием фермента холестеринэстеразы (ХЭ). При участии фермента холестериноксидазы (ХО) холестерин окисляется до 4-холестен-3-она. Освобождающаяся перекись водорода, при участии фермента пероксидазы, способствует окислительному азосочетанию 4 - аминоантипирина (4-ААП) и фенола с образованием окрашенного соединения (хинониминовый краситель). Интенсивность окраски реакционной среды пропорциональна содержанию холестерина в исследуемом материале и определяется фотометрически при длине волны 500 (490-520) нм.

Схема реакции:

 

Эфиры холестерина + Н2О  холестерин + жирные кислоты

Холестерин + О2  4-холестен-3-он + Н2О2

Н2О2 + 4-ААП + фенол хинониминовый краситель + 4 Н2О

 

Исследуемый материал:

Сыворотка, гепаринизированная или ЭДТА-плазма крови без следов гемолиза.

Проба стабильная 7 дней при температуре 2-8˚С.

Состав набора:

Монореагент (250 мл)

Калибратор - раствор холестерина 5,17 ммоль/л (1,5 мл)

Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность:

Монореагент готов к применению; после вскрытия флакона монореагент стабилен не менее 6 месяцев при температуре 2-8 ˚С в защищенном от света месте. Тщательно закрывать флакон с монореагентом после каждого использования. Бледно-розовая окраска монореагента с величиной оптической плотности до 0, 200 А, измеренной против дистиллированной водой при длине волны 500 нм, не влияет на правильность определения холестерина в исследуемом образце.

Калибратор готов к применению; после вскрытия флакона калибратор стабилен не менее 6 месяцев при температуре 2-8 ˚С.

Невскрытые реагенты стабильны в течение года при температуре 2-8 ˚С, монореагент в защищенном от света месте.

 

Процедура анализа:

Компоненты реакционной смеси	Опытная проба	Калибровочная проба	Контрольная проба
Монореагент, мл	2,0	2,0	2,0
Сыворотка (плазма), мл	0,02	-	-
Калибратор, мл	-	0,02	-
Вода дистилл., мл	-	-	0,02

 

Реакционную смесь тщательно перемешайте и инкубируйте не менее 15 минут при комнатной температуре (18-25 ˚С) или 10 минут при температуре 37˚С. После окончания инкубации измерьте оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной (холостой) пробы при длине волны 500 нм (490-540 нм). Окраска растворов стабильна в течение 1 часа после окончания инкубации при хранении проб в защищенном от света месте при комнатной температуре. Объемы исследуемого образца и монореагента можно изменить, соблюдая соотношение 1: 100.

 

Автоматические анализаторы:

Длина волны                                       500 нм

Измерение против                        Контрольной пробы

Метод измерения                                Конечная точка

Изменение оптической плотности      Возраст

Температура                                       37 ˚С

Соотношение образец/реагент           1: 100

Время преинкубации                          3 секунды

Время реакции                                    600 секунд

Предел абсорбции контрольной пробы 0, 200 А

Предел максимальной абсорбции     2,000 А

Калибратор                                                  5,17 ммоль / л

Линейность                                          0,5-25,8 ммоль / л

 

Расчет концентрации холестерина (С, моль / л) проведите по формуле:

 

С= × 5,17 ммоль / л,

 

где Е пробы - ед. опт. плотность исследуемой пробы

Е калибр. - ед. опт. плотность калибровочной пробы

,17 ммоль / л - концентрация холестерина в калибраторе

Аналитические характеристики:

Линейность - 0,5-25,8 ммоль /л

Коэффициент вариации - не менее 5 %.