Реакция агглютинации с помощью неполных анти-D-антител (IgG) в присутствии высокомолекулярных добавок

Реакция проводится либо со специально приготовленным реагентом, уже содержащим усилитель (универсальный реагент с полиглюкином или альбумином для плоскости), либо усилитель добавляют в процессе проведения реакции (реакция конглютинации с желатином в пробирке).

Техника постановки реакции агглютинации на плоскости не отличается от описанной в гл.6.2.2.1. Однако универсальные реагенты могут давать ложноположительную реакцию с резус-отрицательными эритроцитами за счет содержащихся в них высокомолекулярных веществ, а также могут вызывать агглютинацию эритроцитов, покрытых антителами другой (не антирезус) специфичности. Поэтому необходимо проведение параллельных тестов с контрольным раствором используемого усилителя, но без анти-0-антител. Если контрольный раствор вызывает агглютинацию эритроцитов, то результаты тестирования не достоверны и следует повторить определение с другим реагентом, содержащим полные антитела IgM (лучше с моноклональными).

Реакции конглютинации с применением желатина. Для проведения этого теста могут быть использованы моноклональные реагенты и стандартные изоиммунные антирезус сыворотки с неполными антителами.

1. Вносят в пробирку 1 каплю (около 0,05 мл) исследуемой крови или взвеси эритроцитов (примерно 50%) в сыворотке.
2. Добавляют 2 капли (0,1 мл) 10% раствора желатина, предварительно подогретого до разжижения при +46...+48°С.
3. Добавляют 2 капли (0,1 мл) реагента анти-D и смешивают.
4. Помещают пробирку в водяную баню с температурой +46...+48°С на 5–10 мин или в суховоздушный термостат при той же температуре на 30 мин.
5. Доливают в пробирку 5–8 мл физиологического раствора и осторожно 1–2 раза переворачивают закрытую пробкой пробирку для перемешивания.
6. Определяют наличие агглютинатов, просматривая пробирку на свет невооруженным глазом или через лупу.
7. Немедленно записывают результаты определения.

Желатиновая проба требует обязательного проведения следующих контролей:

со стандартными резус-положительными эритроцитами;

со стандартными резус-отрицательными эритроцитами;

с исследуемыми эритроцитами и раствором желатина, но без анти-0-антител.

При положительном результате агглютинаты различимы в виде агрегатов разной величины на прозрачном фоне – кровь является резус-положительной. При отрицательном результате в пробирке агрегатов нет, а видна равномерно окрашенная непрозрачная взвесь эритроцитов – кровь является резус-отрицательной. Если наблюдается мелкозернистая, вызывающая сомнение агглютинация, то кровь необходимо тестировать в непрямом антиглобулиновом тесте (см. гл.6.2.2.3). Результаты желатиновой пробы являются достоверными только в случае, когда желатин сам не вызывает агглютинацию исследуемых эритроцитов, а результаты контролей со стандартными эритроцитами соответствуют ожидаемым. В случае неадекватных результатов контролей определение резус-принадлежности следует повторить с использованием другого реагента или образца желатина. Если желатин вызывает сам по себе агглютинацию исследуемых эритроцитов, то можно предполагать наличие на них антиэритроцитарных антител антирезус или иной специфичности (это наблюдается при гемолитической болезни новорожденных, аутоиммунной гемолитической анемии и некоторых инфекционных заболеваниях). В этом случае кровь должна быть направлена на исследование в специальную серологическую лабораторию.

Непрямой антиглобулиновый тест с помощью неполных анти-0-антител (IgG)

• Приготовить 2–5% взвесь трижды отмытых в физиологическом растворе исследуемых эритроцитов. Для этого поместить в пробирку 5 капель (около 0,25 мл) исследуемой крови, трижды отмыть в 5–10 мл физиологического раствора; суспендировать осадок эритроцитов в 2–3 мл физиологического раствора или, предпочтительнее, в 2–3 мл раствора LISS, в котором фиксация антител на эритроцитах прочнее и происходит быстрее, чем в физиологическом растворе.
• Внести 1 каплю анти-0-реагента в чистую маркированную пробирку.
• Добавить 1 каплю 2–5% взвеси эритроцитов.
• Инкубировать смесь при +37°С 30–45 мин (если эритроциты взвешены в физиологическом растворе) или 10–15 мин (если эритроциты взвешены в LISS).
• Отмыть эритроциты 1 раз (в случае использования мо-ноклонального реагента) или 3 раза (в случае использования изоиммунной анти-0-сыворотки) большим объемом (5–10 мл) физиологического раствора. Однократная отмывка допустима только при использовании моноклональных реагентов. Полностью удалить физиологический раствор.
• Добавить к осадку 1 каплю антиглобулинового реагента и тщательно смешать.
• Центрифугировать 15–20 с при 2 000–3 000 об./мин.
• Мягко ресуспендировать осадок и визуально определить наличие агглютинации.
• Немедленно записать результаты определения.

При отсутствии агглютинации кровь является резус-отрицательной. При положительной реакции – резус-положительной; подгруппы Du могут вызывать слабую агглютинацию даже в этом высокочувствительном тесте. Прежде чем отнести донора Du к резус-положительным следует подтвердить заключение контрольным исследованием антиглобулиновой сыворотки со стандартными эритроцитами. Если контрольный тест положительный, интерпретация не является достоверной. В этом случае реципиент должен получать только резус-отрицательную кровь (эритроциты), а кровь такого донора не должна использоваться для трансфузий до окончательного выяснения его резус-принадлежности.

Агглютинация эритроцитов, обработанных протеолитическими ферментами, с помощью неполных анти-0-антител (IgG)

Неполные антитела способны вызывать прямую агглютинацию в солевой среде эритроцитов, обработанных бромелином, папаином, трипсином и другими протеазами. Этот метод высокочувствителен и надежен при выявлении слабых форм D-антигена. Он используется, главным образом, при автоматическом определении групп крови в системах "Gruppomatic”, в которых обеспечивается стандартность обработки эритроцитов ферментами и специально подбирается нужное разведение реагента, так как для этого теста характерен феномен прозоны (ингибирование агглютинации избытком антител).

При неавтоматизированном определении групп крови метод может быть использован в специализированных серологических лабораториях.