Субпопуляции Т-лимфоцитов. CD – номенклатура.

БИЛЕТ № 20

Методы индикации вирусов.

Эти методы включают: цитопатогенное действия вирусов; выявление бляшек по Дюльбекко и Фогт; индикацию вирусов в куриных эмбрионах; индикацию вирусов на лабораторных животных и другие.

Цитопатогенное действие вирусов. Индикация вирусов в зараженных культурах клеток является основным методом в вирусологии. Действие вируса на клетки определяется путем регистрации цитопатогенного действия (ЦПД). В результате этого происходят дегенеративные изменения и разрушения клеток.. Цитопатический эффект обнаруживается под малым увеличением микроскопа через стекло сосуда, в котором производится культивирование зараженных клеток. При наличии вируса в клеточной культуре обнаруживают дегенерацию клеток и нарушение структуры клеточного слоя.

При микроскопнровании окрашенных препаратов обнаруживаются многоядерные клетки и симпласты, характерные для цитопа-f тогенного действия вирусов кори, осповакцины, парагриппозных вирусов и других. Для выявления названных цитологических изменений обычно пользуются методом окраски Препаратов гематоксилином и эозином. Следует особо отметить, что степень и характер повреждения клеток обусловлены рядом факторов, важнейшими из которых являются свойства вируса, свойства используемых клеток, доза вируса и состав питательной среды.

Метод бляшек по Дюльбекко и Фогт. Для раннего выявления вирусов в клеточных культурах Дюльбекко и Фогт (1954) разработали новый тест, получивший название метода пятен (бляшек). В основе метода лежит образование в местах цитопатогенного действия вируса обесцвеченных пятен, так как пораженные клетки теряют способность сохранять или воспринимать витальные окрашивания. Пятна, или бляшки, по Дюльбекко, представляют собой.изолированные колонии вируса в однослойных культурах, видимые микроскопии чески в виде неокрашенных. округлых форм, четко выделяющиеся на фоне живых клеток, окрашенных в красный цвет.

Лабораторная диагностика RS – инфекции.

Респираторно-синцитиальный вирус ызывает заболевания нижних дыхатьльных путей у новорожденных и детей раннего возраста. Материалом для исследования служат отделяемое носоглотки, ткань легких. В вирусологическом методе используют культуры клеток. Индикацию вируса производят по характеру ЦПД-образованию синцития, а идентификацию вирусов – с помощью РН, РСК. Возможно применение серологического метода, направленного на обнаружение специфического антигена с помощью РИФ, ИФА; реже, используя РСК, РН, выявляют антитела в сыворотке крови больного.

 

БИЛЕТ № 21

1. Механизмы репликации вирусных нуклеиновых кислот.

ДНК обычно существует в виде двухцепочечных структур: две полинуклеотидные цепочки соединены водородными связями и закручены таким образом, что образуется двойная спираль. РНК, напротив, обычно существует в виде одноцепочечных структур. Однако геном отдельных вирусов представляет собой одноцепочечную ДНК или двухцепочечную РНК. Нити (цепочки) вирусной нуклеиновой кислоты, двойные или одинарные, могут иметь линейную форму или замыкаться в кольцо. Первый этап репликации вирусов связан с проникновением вирусной нуклеиновой кислоты в клетку организма-хозяина. Этому процессу могут способствовать специальные ферменты, входящие в состав капсида или внешней оболочки вириона, причем оболочка остается снаружи клетки или вирион теряет ее сразу после проникновения внутрь клетки. Вирус находит подходящую для его размножения клетку, контактируя отдельными участками своего капсида (или внешней оболочки) со специфическими рецепторами на поверхности клетки по типу "ключ - замок". Если специфические ("узнающие") рецепторы на поверхности клетки отсутствуют, то клетка не чувствительна к вирусной инфекции: вирус в нее не проникает.

Для того чтобы реализовать свою генетическую информацию, проникшая в клетку вирусная ДНК транскрибируется специальными ферментами в мРНК. Образовавшаяся мРНК перемещается к клеточным "фабрикам" синтеза белка - рибосомам, где она заменяет клеточные "послания" собственными "инструкциями" и транслируется (прочитывается), в результате чего синтезируются вирусные белки. Сама же вирусная ДНК многократно удваивается (дуплицируется) при участии другого набора ферментов, как вирусных, так и принадлежащих клетке.

Синтезированный белок, который используется для строительства капсида, и размноженная во многих копиях вирусная ДНК объединяются и формируют новые, "дочерние" вирионы. Сформированное вирусное потомство покидает использованную клетку и заражает новые: цикл репродукции вируса повторяется. Некоторые вирусы во время отпочковывания от поверхности клетки захватывают часть клеточной мембраны, в которую "заблаговременно" встроились вирусные белки, и таким образом приобретают оболочку. Что касается клетки-хозяина, то она в итоге оказывается поврежденной или даже полностью разрушенной.

У некоторых ДНК-содержащих вирусов сам цикл репродукции в клетке не связан с немедленной репликацией вирусной ДНК; вместо этого вирусная ДНК встраивается (интегрируется) в ДНК клетки-хозяина. На этой стадии вирус как единое структурное образование исчезает: его геном становится частью генетического аппарата клетки и даже реплицируется в составе клеточной ДНК во время деления клетки. Однако впоследствии, иногда через много лет, вирус может появиться вновь - запускается механизм синтеза вирусных белков, которые, объединяясь с вирусной ДНК, формируют новые вирионы.

У некоторых РНК-содержащих вирусов геном (РНК) может непосредственно выполнять роль мРНК. Однако эта особенность характерна только для вирусов с "+" нитью РНК (т.е. с РНК, имеющей положительную полярность). У вирусов с "?" нитью РНК последняя должна сначала "переписаться" в "+" нить; только после этого начинается синтез вирусных белков и происходит репликация вируса.

Радиоиммунный анализ.

Высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген-антитело с применением антигенов или антител, меченых радионуклидом. После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике(бета- или гамма-излучение):интенсивность излучения прямопропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. При твердофазном варианте РИА один из компонентов реакции (антиген или антитела) сорбирован на твердом носителе. Другой вариант метода – конкурентный РИА: искомый антиген и меченый радионуклидом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. Этот вариант используют для определения количества антигена в исследуемом материале. РИА применяют для выявления антигенов микробов, определения гормонов, ферментов, лекарственных веществ и иммуноглобулинов.

БИЛЕТ № 22

РТГА.

Реакция торможения гемагглютинации основана на блокаде, подавлении антигенов вирусов антителами иммунной сыворотки, в результате чего теряют свойство агглютинировать эритроциты. РТГА применяют для диагностики многих вирусных болезней, возбудители которых могут агглютинировать эритроциты различных животных.

4. Биохимические и антигенные свойства эшерихий, значение в диагностике.

Обладает выраженной биохимической активностью. Биохимические свойства, составляющие основу дифференциальной диагностики при проведении бактериологического исследования, следующие: продукция кислоты и газа при ферментации глюкозы, ферментация лактозы, неспособность образовывать сероводород, продукция индола. Обладает сложной антигенной структурой: а)имеет соматический О-антиген, определяющий серогруппу; б) поверхностный К-антиген может быть представлен 3 антигенами: А, B, L, отличающиеся по чувствительности к температуре и химическим веществам; в) типоспецифическим антигеном явл Н-антиген. Эшерихии делятся на условно-патогенные и диареегенные. Условно-патогенные способны вызывать эндогенные гнойно-воспалительные процессы различной локализации, называемые парентеральными эшерихиозами. Парентерельный эшерихиоз может протекать в виде сепсиса, нагноения ран, вторичной пневмонии, инфекции мочевыводящих путей. Патогенные эшерихии явл возбудителями кишечного эшерихиоза, ОКИ,получили название диареегенных.

Билет № 23

Билет №24

Мутации у бактерий. Виды.

Мутации- это изменения в последовательности отдельных нуклеотидов ДНК, которые ведут к таким проявлениям, как изменения морфологии бактериальной клетки, возникновение потребностей в факторах роста, например в АК, витаминах,т.е ауксотрофности; к устойчивости к антибиотикам, изменению чувствительности к температуре, снижению вирулентности.

По протяженности изменений повреждения ДНК различают мутации точечные, когда повреждение заканчивается одной парой нуклеотидов, и протяженные или аберрации. В последнем случае могут наблюдаться выпадения нескольких пар нуклеотидов, которые называют делецией, добавление нуклеотидных пар, т.е дупликация, перемещения фрагментов хромосомы, транслокации и перестановки нуклеотидных пар – инверсии.

Мутации могут быть спонтанными, т.е возникающими самопроизвольно, и индуцированными.

Точечные спонтанные мутации возникают в результате возникновения ошибок при репликации ДНК, что связано с таутомерным перемещением электронов в азотистых основаниях. Спонтанные хромосомные аберрации возникают вследствие перемещения подвижных генетических элементов. Индуцированные мутации появляются под влиянием внешних факторов, которые называются мутагенами.

Мутация, приводящая к потере функции, называется прямой мутацией. Если происходит восстановление исходного генотипа, то мутация, восстанавливающая фенотип и генотип, называется обратной или прямой реверсией. Если мутация восстанавливает фенотип, но не восстанавливая генотип, то такой мутация называется супрессорной.

Экспресс-диагностика ОРВИ

Обнаруживают вирусные антигены в инфицированных клетках. Применяют РИФ (прямой и непрямой метод) с использованием меченных флюорохромами специфических антител, а также ИФА. Для труднокультивируемых вирусов используют генетический метод (ПЦР).

 

 

 

БИЛЕТ № 20

Методы индикации вирусов.

Эти методы включают: цитопатогенное действия вирусов; выявление бляшек по Дюльбекко и Фогт; индикацию вирусов в куриных эмбрионах; индикацию вирусов на лабораторных животных и другие.

Цитопатогенное действие вирусов. Индикация вирусов в зараженных культурах клеток является основным методом в вирусологии. Действие вируса на клетки определяется путем регистрации цитопатогенного действия (ЦПД). В результате этого происходят дегенеративные изменения и разрушения клеток.. Цитопатический эффект обнаруживается под малым увеличением микроскопа через стекло сосуда, в котором производится культивирование зараженных клеток. При наличии вируса в клеточной культуре обнаруживают дегенерацию клеток и нарушение структуры клеточного слоя.

При микроскопнровании окрашенных препаратов обнаруживаются многоядерные клетки и симпласты, характерные для цитопа-f тогенного действия вирусов кори, осповакцины, парагриппозных вирусов и других. Для выявления названных цитологических изменений обычно пользуются методом окраски Препаратов гематоксилином и эозином. Следует особо отметить, что степень и характер повреждения клеток обусловлены рядом факторов, важнейшими из которых являются свойства вируса, свойства используемых клеток, доза вируса и состав питательной среды.

Метод бляшек по Дюльбекко и Фогт. Для раннего выявления вирусов в клеточных культурах Дюльбекко и Фогт (1954) разработали новый тест, получивший название метода пятен (бляшек). В основе метода лежит образование в местах цитопатогенного действия вируса обесцвеченных пятен, так как пораженные клетки теряют способность сохранять или воспринимать витальные окрашивания. Пятна, или бляшки, по Дюльбекко, представляют собой.изолированные колонии вируса в однослойных культурах, видимые микроскопии чески в виде неокрашенных. округлых форм, четко выделяющиеся на фоне живых клеток, окрашенных в красный цвет.

Субпопуляции Т-лимфоцитов. CD – номенклатура.

Т-лимфоциты – это сложная по составу группа клеток, которая происходит от полипотентной стволовой клетки костного мозга, а созревают и дифференцируется в тимусе из предшественников. На долю этих клеток приходится около 75% всей лимфоидной популяции. Все Т-лимфоциты имеют гладкую поверхность, их общим маркером явл CD3, а также рецептор к эритроцитам барана. В зависимости от строения Т-клеточного антигенного рецептора и функциональной направленности сообщество Т-лимфоцитов может быть разделено на отдельные группы. Различаю два типа Т-клеточного антигенного рецептора:αβ и γδ. Первый тип гетеродимер, который состоит из двух полипептидных цепей – α и β; он характерен для традиционных Т-лимфоцитов, известных как Т-хелперы и Т-киллеры. Второй тип обнаруживаеся на поверхностной популяции γδТ- лимфоцитов. Т-лимфоциты также разделяются на две субпопуляции: иммунорегуляторы и эффекторы. Т- хелперы- субпопуляция Т-лимфоцитов, которые выполняют регуляторную функцию. На наружной поверхности их цитоплазматической мембраны определяются молекулы CD4. Т-киллер – субпопуляция Т-лимфоцитов-эффекторов. На поверхности их цитоплазматической мембраны определяются молекулы CD8.

3. Иммуноферментный анализ.

ИФА – выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой. После соединения антигена с меченной ферментом иммнунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом, и изменяется цвет продукта реакции – интенсивность окраски прямопропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. Твердофазный ИФА – наиболее распространенный вариант иммунологического теста, когда один из компонентов иммунной реакции сорбирован на твердом носителе, например в лунках планшеток из полистирола. При определении антител в лунки планшеток с сорбированным антигеном последоватьльно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом, и субстрат (хромоген) для фермента. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем тщательного промывания. При положит результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителами. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку против антигена, мечнную ферментом, а затем субстрат для фермента. Конкурентный вариант ИФА: искомый антиген и меченный ферментом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. Другой тест – искомые антитела и меченные антитела конкурируют друг с другом за антигены. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней.