Действие химических факторов на микроорганизмы. Дезинфекция

Дезинфекция (обеззараживание) - (франц. "des" означающее удаление, уничтожение чего-либо; лат "inficere" -заражать, портить, отравлять) - удаление и уничтожение ве­гетативных форм микроорганизмов во внешней среде путем воздействия на них физическими и химическими факторами.

Дезинфекция предотвращает размножение и распростра­нение микроорганизмов во внешней среде, заражение пациен­тов и медицинского персонала. В хирургии дезинфекции под­вергаются предметы и материалы, использованные при опе­рациях и манипуляциях (особенно у "гнойных" и инфекцион­ных больных), а также имевшие контакт с биологическими жидкостями и выделениями человека. Дезинфекции, без пос­ледующей стерилизации, подвергаются все изделия и матери­алы, которые при последующем их использовании не будут иметь контакта с раневой поверхностью, кровью и другими биологическими жидкостями организма, например, постель­ное белье, одежда, подкладные судна и т.д. Все предметы и материалы, соприкасающиеся при их применении с раневой поверхностью, биологическими жидкостями организма, сли­зистыми оболочками, подвергаются предстерилизационной очистке с последующим проведением стерилизации.

Стандартные методы дезинфекции и порядок их осущес­твления определены ОСТ 42-21-2-85 МЗ СССР.

Дезинфекция изделий, помещений медицинского назна­чения достигается применением растворов химических веществ (химический метод), а также кипячением, использованием го­рячего пара и воздуха, УЗ-волн, и т.д. (физический метод).

Химический метод дезинфекции. Препараты, применяе­мые для проведения химической дезинфекции, подразделяют­ся на три группы:

1. Средства мягкой дезинфекции (хлорамин, роккал, дихлор-1, гибитан, первомур и т.д.). Применяются для дезинфек­ции кожи человека, хирургических инструментов, а также не­значительно загрязненного белья и одежды. Они не должны вызывать дерматитов или раздражения кожных покровов, ал­лергических реакций, не должны обладать неприятным запа­хом и повреждать обрабатываемые материалы.

2. Средства грубой дезинфекции (хлорная известь, ли­зол, крезол, фенол, крезолит и т.д.). Пригодны для обработки сильно загрязненных материалов, на которых имеется боль­шое количество органических веществ. Они пригодны для де­зинфекции мебели, раковин, подкладных суден, мочеприемников, помещений, обуви, а также выделений человека.

3. Средства для дезинфекции воздуха в закрытых поме­щениях и поверхностей, находящихся там предметов. Имеют ограниченное применение в лечебно-профилактических учреж­дениях.

 

Питание бактерий

По типу питания бактерии подразделяются на аутотрофов и гетеротрофов. Аутотрофы способны усваивать углерод из СО2.

Гетеротрофы усваивают углерод только из органических соединений.

Гетеротрофы в свою очередь подразделяются на сапрофитов и паразитов. Сапрофиты – свободноживущие микроорганизмы, в качестве питательных веществ используют органические соединения погибших организмов или продукты их жизнедеятельности. Средой обитания бактерий-паразитов является живой организм. Бактерии паразиты являются патогенными, т.е. болезнетворными. Бактерии-симбионты обитают в кишечнике человека и животных и выполняют жизненно-важные функции для организма хозяина.

Изменчивость в потребностях метаболитов. Под влиянием антибиотиков и химических веществ, Х-лучей, ультрафиолето­вого облучения и других воздействий у некоторых микробов появляется потребность в определенных аминокислотах, факто­рах роста, в которых не нуждались исходные культуры. Такие варианты, которые для своего развития нуждаются в специаль­ных веществах, называют ауксотрофами в отличие от исходных штаммов — прототрофов. Ауксотрофы отличаются от про-тотрофов тем, что у них часть метаболических процессов блокирована и они лишены возможности синтезировать необхо­димые им метаболиты. Так, например, после воздействия на Е. соН Х-лучей она стала нуждаться для своего роста в гйдролизате казеина или экстракте дрожжей, в то время как исходный штамм мог развиваться в минимальной среде, в которой отсутствовали аминокислоты и витамины. Ауксотроф-ность можно воспроизвести и в отношении триптофана, антра-ниловой кислоты, пенициллина и других веществ.

Физические и химические факторы могут индуцировать раз­личные изменения способности синтеза важных метаболитов в бактериальных культурах. Эти изменения происходят под вли­янием механизмов генетической информации.

 

Питательные среды

В лабораторных условиях бактерии выращивают на пита­тельных средах. Большое значение для роста и размножения бактерий имеют температурные условия. Все микроорганизмы по отношению к температурному режиму подразделяются на три группы: психрофильные (холодолюбивые), мезофильные (средние), термофильные (теплолюбивые) (табл. 5). Бактерии могут размножаться в широком диапазоне температур—от 0°С до +90°С.

Для жизнедеятельности бактерий большое значение имеет рН среды. Каждый вид микроба в процессе эволюции приспособил­ся для существования в определенных границах рН, за предела­ми которых жизнедеятельность его невозможна.

Предполагают, что рН влияет на активность ферментов. В зависимости от рН слабые кислоты в кислой среде находятся в виде молекул, а в щелочной—в виде ионов. Сапрофиты могут жить в условиях с чрезвычайно широким диапазоном рН — от 2 до 8,5. Патогенные же виды микробов растут при рН 6—8 (табл. 6).

Питательные среды должны быть легкоусвояемыми, с изве­стным составом азотистых и углеводных веществ, витаминов, необходимой концентрацией солей, изотоничные, стериль­ные, обладать буферными свойствами, иметь оптимальную вяз­кость и определенный окислительно-восстановительный потен­циал.

Питательные среды подразделяются на четыре основные группы: универсальные, специальные, избирательные (электив­ные) и дифференциально-диагностические.

I. Универсальные среды (мясо-пептонный бульон, мя­со-пептонный агар) содержат питательные вещества, в присут­ствии которых растут многие виды патогенных и непатогенных бактерий. П. Специальные среды применяют для выращивания бактерий, не размножающихся на универсальных средах. К специальным средам относятся кровяной агар, сывороточ­ный агар, сывороточный бульон и др.

III. Избирательные (элективные) среды; в них хоро­шо развиваются только определенные виды бактерий, плохо или совсем не растут другие виды. К ним относятся среды обогащения, в которых интересующий исследователя вид ра­стет интенсивнее и быстрее сопутствующих бактерий. Так, например, щелочная пептонная вода и щелочной мясо-пептонный бульон являются средами обогащения (элективны­ми) для холерного вибриона. Питательные среды, содержащие определенные концентрации пенициллина или других антибиоти­ков, элективны для устойчивых к этим антибиотикам штаммам и вместе с тем селективны для антибиотикочувствительных культур.

IV. Дифференциально-диагностические среды ис­пользуют для дифференциации определенных видов бактерий по их культуральным и биохимическим свойствам. К ним относятся:

1) среды для определения протеолитической способности микробов (мясо-пептонный желатин и др.);

2) среды для определения ферментации углеводов (среды Гисса и др.); среды для дифференциации бактерий, ферментиру­ющих и не ферментирующих лактозу (Эндо, Дригальского, Плоскирева и др.);

3) среды для определения гемолитической способности- (кро­вяной агар);

4) среды для определения восстановительной (редуцирующей) способности микроорганизмов;

5) среды, содержащие вещества, ассимилируемые только определенными микробами.

Кроме того, в лабораторной практике применяют консервиру­ющие среды. Их используют для первичного посева и транспор­тировки исследуемого материала; они предотвращают отмира­ние патогенных микробов и способствуют подавлению сапрофи-тов. К этой группе сред относят глицериновую смесь, состо­ящую из 2 частей 0,85% раствора хлорида натрия, 1 части глицерина и 1 части 15—20% раствора фосфата натрия, а также глицериновый консервант с солями лития, гипертонический раствор хлорида натрия и др.

В настоящее время многие питательные среды изготовляют фабричным способом и выпускают в виде порошка. Они удобны в работе, стойки и весьма эффективны.

Для культивирования бактерий стали широко применять безбелковые среды, в которых хорошо растут многие гете­ротрофные, в том числе и патогенные, микробы. Состав этих сред сложен, они включают большое количество компо­нентов.

Культивирование в синтетических средах с использованием метода меченых атомов дает возможность более детально дифференцировать микробы по характеру их биосинтеза.

С целью дифференциации прототрофных и ауксотрофных бактерий широко используют селективные среды. Прото-трофы растут на минимальной среде, содержащей только соли и углеводы, так как они сами способны синтезировать нужные им для развития метаболиты, в то время как ауксотрофы нуждаются в средах, содержащих определенные аминокислоты, витамины и другие вещества.

По консистенции питательные среды бывают плотные (мясо-пептонный агар, мясо-пептонный желатин, свернутая сыворот­ка, картофель, свернутый яичный белок), полужидкие (мясо-пептонный агар) и жидкие (пептонная -вода, мясо-пептонный бульон, сахарный бульон и др.).

13. Бактериологический метод изучения микроорганиз­мов

Выделение отдельных видов бактерий из исследуемого материала, содержащего, как правило, смесь различных микро­организмов, является одним иэ этапов любого бактериологи­ческого исследования, проводимого с различными целями: диагностики заболеваний, определения микробной обсеменен-ности окружающей среды и т.д. Для выделения чистой куль­туры применяют методи, основанные на: 1) 'механическом разобщении бактериальных клеток; 2) предварительной обра­ботке исследуемого материала с помощью физических или химических факторов, оказывающих избирательное антибактери­альное действие; 3) избирательном подавлении размножения сопутствующей микрофлоры физическими или химическими факторами во время инкубации посевов; 4) способности не­которых бактерий быстро размножаться в организме чувстви­тельных к ним лабораторных животных (биопробы).

Для механического разобщения клеток бактерий иссле­дуемый материал петлей или пипеткой наносят на поверхность питательного агара в чашку Петри и равномерно распределяют стерильным шпателем. Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) материал растирают по поверхности питательного агара во второй чашке.

Посев материала также делают бактериальной петлей. Для этого в верхней части чашки густо заштриховывают зигзаго­образными движениями петли небольшой участок агаровой среды, освободив таким образом петлю от излишнего материала. Затем наносят параллельные штрихи по остальной части среды. Иногда применяют метод пластинчатых разводок, который заключается в перемешивании различных разведении исследу­емого материала с расплавленным и остуженным питательным агаром в колбе или пробирке. После этого его разливают в чашки Петри и инкубируют в термостате. Для уничтожения сопутствующих неспорообразующих микроорганизмов исследуемый материал прогревают при 80°С или подвергают кратковременному кипячению. Споры микроорганизма при этом охраняются и при посеве прогретого материала на питательную еду прорастают, образуя чистую бактериальную культуру в Ш случае, если принадлежат только данному виду. Если в исследуемом материале содержатся споры разных видов бактерий, то данный метод для получения чистой культуры непри-оден.

Подавление размножения посторонней микрофлоры при еве исследуемого материала на питательные среды доста­ется воздействием на них каких-либо факторов, не препят-рпвующих размножению основного микроба: неодинаковой ьной температуры для роста разных бактерий, анти-этиковили других химических веществ, а такжефагов, первом случае посевы инкубируют при температуре, задер-вающей рост сопутствующей микрофлоры. Так, например, выделения чистой культуры бактерий чумы посевы инку-руют при температуре около 5°С. Во втором случае в пита-ьную среду вносят соответствующее вещество или фаг в рого определенной концентрации, препятствующей размно-внию сопутствующих бактерий, но не оказывающей выражен­ного ингибирующего действия на исследуемый микроб. Кроме упомянутых методов, в бактериологической практике адгда применяются и другие, например для выделения чистой ультуры бактерий протея (Рго1еш ушеапз) используют его юсобность к «ползучему» росту.

Для выделения чистых культурбольшинства бактерий обычно затрачивается не более 2—3сут. Для выращивания микобактерий туберкулеза этот срок удлиняется до 4-6 нед. Процесс выделения чистой культуры можно разделить на Несколько этапов.

Первый этап. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают по Граму или другим методом и микроскопируют. Для посева исследуемый материал в случае необходимости разводят в пробирке со стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Одну каплю приготовленного разведения наносят петлей на поверхность питательного агара в чашку Петри и тщательно втирают шпателем в среду, равномерно распределяя материал по всей ее поверхности. После посева чашку переворачивают дном кверху, подписывают и помещают в термостат при 37°С на 18—24 ч.. р

Второй этап. Просматривают чашки и изучают изоли­рованные колонии, обращают внимание на их форму, величину, консистенцию и другие признаки. Для определения морфологии клеток и их тинкториальных свойств из части исследуемой колонии готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. Для выделения и накопления чистой культуры одну изолированную колонию или несколько различных изолирован­ных колоний пересевают в отдельные пробирки со скошенным агаром или какой-либо другой питательной средой. Для этого часть колонии снимают петлей, не задевая соседние колонии.

Третий этап. Отмечают характер роста выделенной чистой культуры. Визуально чистая культура характеризуется однородным ростом. При микроскопическом исследовании окрашенного мазка, приготовленного из такой культуры, в нем обнаруживаются морфологически и тинкториально однородные клетки. Однако в случае выраженного полиморфизма, присущего некоторым видам бактерий, в мазках из чистой культуры наряду с типичными встречаются и другие формы клеток.

 

ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ

Посевы на анаэробную микрофлору, как спорообразующую (клостридии), так и особенно неспорообразующую (вейлонеллы, бактероиды, пептококки), производят в строго анаэробных условиях. Первоначальные посевы делают на обогатительные среды типа Китта—Тароцци, затем пересевают на плотные среды; сахарный кровяной агар в чашки Петри, в пробирки с сахарным питательным агаром или другими средами для получения изолированных колоний. После инкубации посевов в анаэроб­ных условиях из образовавшихся колоний бактерий готовят мазки, окрашивают, микроскопируют, а затем пересевают на среду Китта—Тароцци и агаровые среды для выделения чистой культуры.

При выделении спорообразующих анаэробных бактерий {клостридии) первоначальные посеву прогревают на водяной бане при 80°С в течение 20 мин для уничтожения вегета­тивных клеток посторонней микрофлоры, которая может при­сутствовать в исследуемом материале (схема 1).

 

ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ

Идентификацию выделенных бактериальных культур прово­дят путем изучения морфологии бактерий, их культуральных, биохимических и других признаков, которые присущи каждому виду.

Культуральные признаки. К ним относятся морфологические особенности колоний бактерий, характер роста на плотных и в жидких питательных средах. Колонии различаются по величине, форме, цвету, консис­тенции, контуру края, структуре и характеру поверхности (рис. 29). По величине колонии могут быть крупные (диаметр более 4-5 мм), средние (2-4 мм) и малые (1—2 мм), по форме — круглые, розеткообразные, в форме листа и т. д. Цвет колонии зависит от выработки определенного пигмента — белого, жел­того, красного и др. Колонии беспигментных бактерий бес­цветны. По консистенции различаются сухие, влажные, сочные или слизистые колонии. Поверхность колонии бывает гладкой, морщинистой, исчерченной, плоской, плосковыпуклой, вдавлен­ной. Край колонии может быть ровным, волнистым, бахром­чатым. Колонии могут иметь аморфную, зернистую, волокнистую внутреннюю структуру.

Характер роста бактерий в чистой культуре, выращенной на скошенном питательном агаре, может быть сухим, влажным, ползучим, складчатым, пигментированным. В жидкой питатель­ной среде одни бактериальные культуры дают диффузное по­мутнение, другие характеризуются придонным, пристеночным ростом; некоторые культуры образуют пленки на поверхности среды, другие — осадок на дне пробирки.

Биохимические признаки. Для определения способности микроорганизмов ферментировать углеводы (сахаролитические свойства) используют короткий и длинный «пестрый» ряд. К первому относятся жидкие среды Гисса с моно- и дисаха-ридами: глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и с шести­атомным спиртом — маннитом. В длинный «пестрый» ряд наряду с перечисленными углеводами вводят среды с разнообразными моносахаридами (арабиноза, ксилоза, рамноза, галактоза и др.), полисахаридами (инулин, крахмал, гликоген и др.) и спиртами (глицерин, дульцит, инозит и др.). В качестве индикатора ко всем средам добавляют реактив Андреде или ВР.

Чистую культуру исследуемого микроба засевают петлей в среды «пестрого» ряда. Посевы инкубируют при 37°С в течение 18—24 ч или более длительно. В том случае, если бактерии ферментируют углевод до образования кислых про­дуктов, наблюдается изменение цвета среды; при разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду с изме­нением цвета появляется пузырек газа в поплавке. Если исполь­зуются среды с полужидким агаром, то образование газа регист­рируется по разрыву столбика. При отсутствии ферментации цвет среды не меняется. Поскольку бактерии ферментируют •не все, а только определенные для каждого вида углеводы, входящие в состав сред Гисса, наблюдается довольно пестрая картина, поэтому набор сред с углеводами и цветным индика­тором называют «пестрым» рядом (рис. 30).

Дыхание бактерий

Дыхание относится к реакциям катаболизма. В результате дыхания происходит расщепление сложных молекул до простых с выделением энергии, которая запасается в молекулах АТФ (КПД около 40%).

АДФ + Ф + Е = АТФ

Процесс дыхания – это реакция окисления углеводов, которая может происходить в бескислородных условиях – анаэробный тип дыхания или гликолиз, и в присутствии кислорода – аэробный тип дыхания или окислительное фосфорилирование.

По типу дыхания бактерии делятся на аэробные и анаэробные. Существуеют бактерии облигатные ааэробы – растут только в присутствии кислорода (например микобактерии туберкулеза). Облигатные анаэробы растут только в бескислородных условиях (например возбудитель ботулизма). Факультативные анаэробы могут расти как в кислородной, так и бескислородной среде (кишечная палочка). Микроаэрофилы – им требуется для своего роста низкая концентрация кислорода (гемофильная палочка).

Брожение не является в полном смысле дыханием – это субстратное фосфорилирование углеводов или гликолиз с образованием пирувата и последующим превращением его в конечные продукты брожения – органические кислоты и спирты.

В результате гликолиза из 1 молекулы глюкозы образуется 2 молекулы АТФ.

Аэробный тип дыхания или окислительное фосфорилирование

Схема Глюкоза- окислительное фисфирилирование- 38АТФ + 6СО2 + 6Н2О

Анаэробный тип дыхания. Схема та же, что при аэробном, но акцептором электронов служат нитриты, либо нитраты, либо фосфаты.

Факультативные анаэробы при отсутствии кислорода получают АТФ с помощью брожения.

Молекулы образовавшегося АТФ участвуют в синтезе органических соединений, отдавая свою энергию и првращаясь в АДФ

А + В + АТФсинтез АВ + АДФ + Ф

Факультативные анаэробы могут размножаться как в присутствии, так и в отсутствие молекулярного кислорода (большинство патогенных и сапрофитных микробов).

Облигатные анаэробы — бактерии, для которых наличие молекулярного кислорода является вредным, задерживающим рост фактором (клостридии столбняка, анаэробной инфекции, ботулизма и др.).