Основные методы расшифровки пространственных структур белков

Для экспериментального исследования пространственной структуры мишени применяют в основном два метода: рентгеноструктурный анализ (РСА) и многомерный вариант спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Эти методы используют для водорастворимых белков, т.к. для анализа требуется получения растворов или монокристаллов белка.

Информация о пространственной структуре белков депонируется в базе данных PDB и доступна через сеть Интернет для свободного пользования.

3. Конечная селекция и приоритезация потенциальных мишеней

В настоящее время этот самый критический этап процесса создания новых лекарств может быть выполнен только вручную. На данном этапе производится оценка возможных финансовых и временных затрат и ряда плохо формализуемых критериев типа функции белка и его метаболической роли. К предпочтительным мишеням относят ферменты клеточной стенки, компоненты синтеза витаминов, компоненты систем транскрипции и трансляции. Предпочтительны также ферменты, катализирующие ключевые стадии метаболизма. Что касается структурных и транспортных белков, а также ферментов альтернативных метаболических путей, то их лучше исключать из списка потенциальных мишеней. С технологической точки зрения более предпочтительны водорастворимые белки по сравнению с мембранными.

54. Как строение хирального центра молекулы влияет на ее биологическую активность? Что такое – хиральный переход?

Специфичность действия ферментов и рецепторов обусловлена необходимостью предварительного образования фермент-субстратного комплекса. Условием образования таких комплексов является геометрическое пространственное соответствие строения активного центра белковой молекулы фермента и молекулы, или части молекулы субстрата (лиганда). Поэтому для ферментов и рецепторов характерно избирательное взаимодействие только с одним оптическим изомером. До настоящего времени синтетические лекарственные вещества синтезируются в виде рацематов или (при наличии в молекуле нескольких хиральных центров) в виде диастереомерных смесей. Лишь около 20 лет назад фармаколог Арене подверг рацематы критике как вещества, «содержащие 50% или более примесей». Это подтолкнуло фармацевтическую промышленность к осознанию проблемы, связанной с тем, что оптически активное лекарство и его зеркальный изомер могут значительно различаться по биологической активности. Действительно оказалось, что некоторые хиральные барбитураты в одной из форм обладают седативной активностью, тогда как другой их энантиомер вызывает судороги. В случае синтетических аналогов морфина один энантиомер может быть сильным анальгетиком, а другой - противокашлевым средством. Некоторые дигидропиридины в одной энантиомерной форме являются блокаторами кальциевых каналов, в то время как другой оптический изомер стабилизирует кальциевый канал в открытом состоянии, так что в результате биологические эффекты в таком рацемате компенсируются. Другой пример дает печально известный препарат Талидомид. Два его энантиомера обусловливают соответственно седативную активность и побочное тератогенное действие, однако разделение рацемата не приводит к продуктам с индивидуальной активностью из-за метаболической взаимотрансформации обоих энантиомеров.

В течение последнего десятилетия компаниям удалось продлить «время жизни» своих хиральных лекарств с помощью так называемого «хирального перехода», когда на рынок поступает биологически активный энантиомер вместо рацемата. Примерами подобной стратегии являются дексфен-флурамин (изъят из продажи в 1997 г.), дексибупрофен, декскетопрофен, левофлоксацин, левалбутерол, левобупивакаин, эзомепразол, левоцетиризин, дексметилпенидат и эсциталопрам.

55. Протопласты. Особенности получения и культивирования протопластов. Чем обусловлено использование протопластов в клеточной инженерии?

Основным объектом клеточной инженерии являются протопласты. Они представляют собой растительные животные или иные клетки, полностью лишенные клеточной оболочки, но сохраняющие способностью осуществлять активный метаболизм, а также реакции биосинтеза и трансформации энергии. Их внутриклеточное содержимое ограниченно только цитоплазматической мембраной.

Получение протопластов

Основным методом является ферментативный способ получения протопластов, при котором клеточная стенка удаляется с помощью ферментов. Таким методом уже в 1919 г. были получены протопласты клеток грибов в результате обработки их клеточных стенок ферментным комплексом, содержащимся в желудочном соке виноградной улитки Helix pomatia. Некоторые виды актиномицетов так же способны продуцировать ферменты лизирующие оболочки различных эукариотических клеток, в частности грибов. В микробиологических экспериментах протопласты получались путем разрушения клеточных стенок бактерий ферментом лизоцимом, выделяемым из белка куриных яиц.

Для удаления клеточной стенки при получении растительных протопластов используются ферментные препараты трех типов – целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Действие этих ферментов состоит в деструкции основных компонентов клеточной стенки, обеспечивающих ее механическую прочность (ригидность). У растительных клеток этими компонентами являются целлюлоза, гемицеллюлоза и пектиновые вещества, которые находятся в клеточной стенке в различных соотношениях.

Формирующиеся протопласты должны находиться в контакте с ферментами минимальное время, после чего их необходимо тщательно отмыть. При этом на всех стадиях необходимо поддерживать жесткие асептические условия. Стерилизация используемых ферментных растворов производится, как правило, путем фильтрования через бактериальные фильтры. Поскольку протопластированные клетки лишены жесткой оболочки, то они становятся очень чувствительными к перепадам концентраций различных веществ внутри клетки и снаружи, в культуральной среде (осмотический шок). Поэтому для отмывки от ферментов нельзя использовать дистиллированную воду, а культивирование протопластов осуществляют на специально подобранных, так называемых гипертонических средах, содержащих различные осмотические стабилизаторы (обычно сорбитол, маннитол в концентрации примерно 125 мг/л). Кроме осмотических свойств среды должны быть подобраны и другие условия. Например, протопласты чаще всего получают в темноте или при слабом освещении. Температурные условия могут варьировать в пределах; 22-28⁰С, стабильности протопластов в определенной степени способствуют высокие концентрации двухвалентных ионов кальция и магния, воздействующих на мембранные системы клетки. Значение рН среды для культивирования протопластов должно быть в проделах 5,5-5,8. Уменьшение рН среды до 3.5 приводит к быстрому (за несколько минут) разрушению и гибели протопластов большинства видов растений. Очень важной проблемой клеточной инженерии растительных организмов является регенерация протопластов. Синтез клеточной стенки у образовавшихся протопластов практически начинается сразу после удаления раствора ферментов, вызвавших ее деструкцию, что можно относительно легко наблюдать с помощью флюоресцентного микроскопа. Для предотвращения преждевременной регенерации в питательную среду вводят кумарин в концентрации 200-250 мг/л.

Некоторые изолированные протопласты за тот короткий промежуток времени, пока они не образуют клеточную стенку, могут сливаться друг с другом, т.е. ведут себя подобно половым клеткам. Такое слияние является спонтанным и происходит чаще, если используются протопласты, полученные из молодых тканей или из суспензионных культур клеток. Однако этот процесс может быть стимулирован путем добавления определенных веществ, что позволяет осуществить слияние не только протопластов одного вида, но и гетерологичных (парасексуальная гибридизация). Довольно эффективным индуцирующим слияние протопластов агентом оказался полиэтиленгликоль (ПЭГ), обеспечивающий сильную адгезию протопластов. С его помощью были получены гибриды протопластов растений и животных клеток, протопласты растений и водорослей. Недостатком данной техники является то, что с ее помощью не удается получить большое количество слившихся протопластов за один прием. Другим способом стимулирования слияния является электропорация – кратковременная обработка культуры протопластов электрическими импульсами высокого напряжения. При всех методах на первом этапе происходит агрегация протопластов вследствие, как полагают, изменений их поверхностного потенциала. Последующее воздействие индукторов слияния сводится к определенным изменениям структуры мембран, увеличивающим их слипаемость и текучесть. Слияние, индуцируемое электрическими импульсами, возникает, вероятнее всего, в результате диэлектрического разрушения (пробоя) соприкасающихся участков мембран протопластов. Вокруг возникающей «дырки» возможен обмен молекулами липидов с образованием липидных мостиков, что, в конечном счете, приводит к слиянию мембран, поскольку возникает энергетически более выгодное состояние, нежели при наличии двух поврежденных мембран.

Разработка методов индуцированного слияния протопластов, а также развитие техники культивировании растительных клеток in vitro, обеспечивающей возможность получения изолированных протопластов, их выращивания с образованием каллуса и в последующем целого растения, обеспечила формирование нового весьма перспективного метода гибридизации растений, получившего название соматической (парасексуальной) гибридизации. Сущность данного приема состоит в том, что в качестве гибридизуемых клеток используют не гаметы (репродукционные клетки), а соматические клетки растений, из которых получаются протопласты. В этом случае становится возможным слияние протопластов полученных даже из разных организмов (межвидовое, межродовое скрещивание). Слияние протопластов обеспечивает объединение не только клеточных геномов, но и двух различных цитоплазм. В большинстве описанных (известных) случаев слияние протопластов высших растений приводит к образованию либо гибрида, либо цибрида. Цибридное растение содержит цитоплазму обоих партнеров, а ядро – одного.

Познавательные статьи:



Коммуникативные барьеры и пути их преодоления

Рынок недвижимости. Сущность недвижимости

Решение задач с использованием генеалогического метода

История происхождения и развития детской игры