Достижения микробиологического синтеза.

Продуцентами валина являются мутантные штаммы многих микроорганизмов: Paracolobacterium coliforme Е. coli, Aerobacter aerogenes, A. cloacae, Brevibacterium ammoniagenes, Bacterium fimbriatum.

В Японии из многочисленных мутантов Micrococcus glutamicus, полученных путем облучения клеток ультрафиолетовыми лучами или Со⁶⁰, было выделено несколько типов ауксотрофных микроорганизмов, которые обладали способностью образовывать в значительных количествах L-лизин. Помимо названных микроорганизмов, в качестве продуцентов могут быть различные штаммы Е. coli, Вас. subtilis, Aerobacter, Corynebacterium и ряд других.

Продуцентами α-аланина являются культуры актиномицетов (Str. tyoideus, Str. avicolustus и др.), а также представители рода Brevibacterium (В. amylolyticurn, В. monoflageium) и Corynebacterium. В отличие от получения других аминокислот микробиологическим способом в виде L-форм α-аланин часто синтезируется в виде рацемата.

Наиболее распространенными промышленными продуцентами глютаминовой кислоты в зарубежных странах являются мутантные штаммы культур Micrococcus glutamicus и некоторые представители рода Brevibacterium. Хорошая аэрация культуральной жидкости является предпочтительным условием для биосинтеза глютаминовой кислоты. В случае, если преобладающим путем диссимиляции глюкозы будет анаэробный гликолиз, то в среде вместо глютаминовой кислоты преимущественно накапливается молочная кислота.

Продуценты глютаминовой кислоты Micrococcus glutamicus и Micrococcus flavum при определенных условиях культивирования могут синтезировать в качестве основного продукта ферментации глютамин.

В последние годы широкое применение в медицинской практике и народном хозяйстве находят различные аминокислоты. Глютаминовую кислоту используют при заболеваниях, связанных с нарушением нервной деятельности. Метионин — при пониженной активности процессов метилирования. Лизин — в качестве добавки к питанию детей гипотрофиков и т. д. Некоторые пищевые белки не содержат в своем составе незаменимых аминокислот. К таким пищевым продуктам незаменимые аминокислоты могут быть добавлены в чистом виде. Это относится как к продуктам питания человека, так и животных. Например, в странах, где основным продуктом питания является рис, целесообразно добавлять к пище лизин, количество которого в белках риса незначительно. Лизин, как известно, относится к числу незаменимых для питания человека аминокислот. Также незаменимой аминокислотой является триптофан. Ее обычно не хватает в рационе с преобладающим углеводным питанием. В Японии широко распространено применение глютаминовой кислоты в виде мононатриевой соли, в качестве вещества, улучшающего вкус пищевых продуктов. Способность аккумулировать в питательной среде аминокислоты обнаружена у многих микроорганизмов. Продуцентом, однако, может считаться такой микроорганизм, который накапливает преимущественно какую-либо одну аминокислоту, так как одновременное присутствие нескольких аминокислот существенно затрудняет выделение и очистку. Такие культуры встречаются сравнительно редко. При отборе продуцентов аминокислот, выделенных из различных почв СССР, было установлено, что большинство из них синтезируют аланин, меньшее количество штаммов образуют глютаминовую и аспарагиновую кислоты, еще меньше — лизин, валин, серии и лейцин.

Строгой корреляции между видовой принадлежностью организма и его способностью образовывать аминокислоты нет, как это имеет место при биосинтезе антибиотиков.

Среди бактерий активные продуценты встречаются в группе микрококков (20%), в то время как неспоровые бактерии содержат небольшое количество активных форм, а культуры азотобактера почти совсем не выделяют аминокислот в среду. Большое количество активных продуцентов аминокислот было найдено среди красных неспороносных дрожжей Rhodotorula. Среди лучистых грибков обнаружено наибольшее количество активных штаммов. Используемые за рубежом для производства многих аминокислот мутантные штаммы Micrococcus glutamicus, по мнению Н. А. Красильникова (1961), относятся также к группе лучистых грибков.

В качестве продуцентов аминокислот используют исключительно мутантные штаммы, полученные под влиянием различных мутагенных факторов. Причем из одной и той же культуры в результате подобного воздействия могут быть получены штаммы, синтезирующие другие различные аминокислоты, чем исходная культура. Так, различные штаммы Micrococcus glutamicus являются продуцентами глютаминовой кислоты, лизина, валина, орнитина, хотя исходный штамм был продуцентом только глютаминовой кислоты. Использование мутантных штаммов позволяет весьма успешно решать вопрос о промежуточных соединениях при биосинтезе различных веществ, в частности аминокислот.

Декстраны представляют собой полиглюкозиды, синтезируемые из сахарозы микроорганизмами, а также ферментными препаратами, выделенными из культур тех же микроорганизмов. В медицинской практике декстраны приобрели значение как заменители плазмы крови. Препараты декстрана выпускаются под различными названиями: декстран, полиглюкин, синкол.

Применяемый в медицине препарат отличается от «нативного» декстрана своим молекулярным весом. Клинический декстран является продуктом деполимеризации нативного декстрана. По своему молекулярному весу он близок к молекулярному весу сывороточного альбумина, а его коллоидно-осмотические свойства близки к коллоидно-осмотическим свойствам плазмы крови. Растворенный в физиологическом растворе 6% декстран применяется как вещество, заменяющее плазму или точнее увеличивающее объем плазмы.

Наиболее часто в качестве продуцентов декстрана встречаются культуры Leuconostoc mesenteroides и Leuconostoc dextranicum, относящиеся к молочнокислым бактериям. В качестве исходного продукта синтеза молекулы декстрана используется сахароза.

Структура декстранов в значительной степени зависит от вида бактерий, с помощью которых осуществляется их синтез, а также от условий культивирования. Основным отличием всех декстранов от полисахаридов типа крахмала и гликогена является то, что огромное большинство глюкозных остатков в их молекулах связано между собой преимущественно α-1-6-глюкозидной связью.

В литературе описаны декстраны, молекулы которых состоят из длинных и практически не разветвленных цепей, где свыше 95% глюкозных остатков связаны в 1:6 положениях.

У других декстранов от длинных цепей, в которых глюкозные остатки связаны между собой в 1:6 положениях, имеются ответвления в 1:4 положениях. Отмечено также наличие 1:3-глюкозидных связей.

На строение молекул декстрана большое влияние оказывает присутствие в среде солей магния. Поэтому декстраны, синтезируемые на среде, богатой и бедной магнием, имеют совершенно различное строение. Этот факт имеет большой интерес в связи с указанием о том, что менее разветвленные молекулы декстранов имеют меньше нежелательных побочных реакций у человека при их введении в организм.

Известны микроорганизмы, колонии которых имеют желтый цвет различных оттенков. Как показал анализ выделенных пигментов, многие из них имеют каротиноидную природу.

По классическому определению каротиноиды — это желтые или красные пигменты алифатического или алициклического строения, построенные из изопреновых остатков (обычно из восьми), последние соединены таким образом, что две ближайшие к центру молекулы метильных групп находятся в положении 1: 6, тогда как все другие боковые метальные группы стоят в положениях 1: 5; серии сопряженных двойных связей составляют хромофорную систему каротиноидов.

Среди большого количества выделенных из микроорганизмов каротиноидов наибольший интерес имеет р-каротин. Молекула β-каротина содержит β-иононовые группировки.

β-Каротин является провитамином, превращающимся в витамин А в организме животного или человека. Некоторые другие каротиноиды, изомеры β-каротина, также могут обладать провитаминной активностью, но не в такой степени, как β-каротин.

Изучение биосинтеза каротиноидов у микроорганизмов проводилось в основном с культурами Blakeslea trispora, Phycomyces blakesleeanus и некоторыми дрожжами.

Механизм биосинтеза каротиноидов полностью не выяснен. Возможно, что он имеет некоторое сходство с синтезом полиеновых антибиотиков, содержащих, как и каротиноиды, сопряженные двойные связи и чередующиеся изопреновые группировки.

Микроорганизмы, очевидно, не синтезируют витамин А, однако культура Pseudomonas aeruginosa при росте на жидкой синтетической среде, в которую входит β-каротин как единственный источник углерода, превращала β-каротин в витамин А.

Аскорбиновую кислоту синтезируют некоторые грибы, относящиеся к семейству Aspergillaceae.

Промышленный биосинтез аскорбиновой кислоты микроорганизмами в настоящее время не имеет распространения. Синтез витамина происходит химическим путем, лишь на одном из этапов при окислении сорбита в сорбозу используют микроорганизмы.

Биосинтез аскорбиновой кислоты в Японии проводят двумя культурами: Acetobacter suboxydans окисляет глюкозу, а затем мутантный штамм Pseudomonas fluorescens доводит процесс до образования витамина. Выход наблюдается в количестве 40—45% от введенного в среду количества глюкозы. Биохимический механизм синтеза молекулы витамина микроорганизмами разрешен ещё не полностью.

Тиамин синтезируют многие микроорганизмы, однако промышленный метод его получения путем ферментации еще не получил распространения.

Одной из причин этого является отсутствие селекционированных высокопродуктивных культур, синтезирующих тиамин в таких количествах, которые позволяют при использовании микробиологического метода получить должный экономический эффект по сравнению с химическим синтезом.

В исследованиях, проведенных с культурой Asp. flavus (Srinivasan, Ramakrishnan, 1962), было отмечено, что витамин содержится как в мицелии, так и в культуральной жидкости.

Рибофлавин синтезируется многими микроорганизмами: бактериями, дрожжами и грибами.

Наиболее известными продуцентами рибофлавина являются Eremothecium ashbyii, Ashbya gossypii, Clostridium acetonobutilicum, некоторые штаммы Candida и Mycobacterium.

Рибофлавин участвует в процессах переноса водорода в окислительно-восстановительных реакциях, являясь составной частью флавинадениндинуклеотида. Рибофлавин присутствует в культуральной жидкости в свободной форме. В клетках E. ashbyii он встречается в виде флавинадениндинуклеотида и свободного витамина, расположенного в виде желтых кристаллов в вакуолях.

Пути биосинтеза молекулы рибофлавина культурами Ashbya gossypii, Eremothecium ashbyii и некоторыми штаммами Candida были изучены с помощью «меченных» по углероду (С14) соединений.

Как известно, пуриновые основания аденин и гуанин входят в состав нуклеиновых кислот. Существует точка зрения, что усиленный синтез культурой рибофлавина является результатом избыточного образования пуринов. Возможно, что, наряду с аденином и гуанином, образуются пока неидентифицированные их дериваты, которые обеспечивают биосинтез молекулы рибофлавина; или аденин и гуанин сами превращаются в ксантин в результате энзиматических реакций.

Биосинтез витамина B₁₂ осуществляется специальными культурами, к числу которых могут быть отнесены актиномицеты (Act. olivaceus, Act. griseus, Act. aureofaciens, Act. fradiae), а также бактерии (Вас. megatherium, Lactobacillus casei, Clostridium tetanomorphicum, пропионовокислые бактерии). Наибольшее промышленное значение имеют Act. olivaceus и Propionobacterium shermanii.

Направленный биосинтез витамина В₁₂ пропионовокислыми бактериями и актиномицетами. Помимо биосинтеза витамина В 12 специальными продуцентами, существуют методы получения витамина параллельно с антибиотиками, в частности с хлортетрациклином. Получение витамина B 12 микробиологическим путем экономически значительно выгоднее, чем из животного сырья, где в качестве исходного продукта используют печень.

Наряду с биосинтезом витамина В 12, который носит название цианкобаламина, могут образоваться его производные: окси-, хлоро-, сульфато, нитрито-кобаламины, не уступающие по своей клинической эффективности цианкобаламину. Другие аналоги витамина B 12 характеризуются тем, что в нуклеотидной части молекулы вместо 5,6-диметилбензимидазола содержится аденин или метиладенин, или их производные. Они не обладают биологической активностью для человека и животных и являются, следовательно, псевдовитаминами.

Преимущество получения витамина В₁₂пропионовокислыми бактериями по сравнению с актиномицетами заключается в том, что они синтезируют исключительно истинный витамин B₁₂.

При изучении продуктов метаболизма Propionibacterium shermanii было обнаружено наличие в среде δ-аминолевулиновой кислоты и свободных порфиринов.

Биосинтез витамина B₁₂ может осуществляться параллельно с хлортетрациклином, реже со стрептомицином. Имеются также указания, что витамин B₁₂ образуется при ферментации нистатина и эритромицина.

Образование витамина B₁₂ и антибиотиков протекает, как правило, почти параллельно.

Некоторые специальные штаммы пропионовокислых бактерий и актиномицетов являются продуцентами только витамина B₁₂ и не синтезируют антибиотики. В промышленности предпочтительно используют пропионовокислые бактерии. Одной из существенных положительных сторон процесса является отсутствие аэрации. Известной трудностью является повышенное требование в соблюдении асептических условий процесса. При биосинтезе антибиотиков, особенно широкого спектра, образующийся в среде антибиотик оказывает бактериостатическое или бактерицидное действие на постороннюю микрофлору. При биосинтезе витамина B₁₂ опасность заражения значительно выше.

Витамин В₁₂ выполняет определенные функции в обмене веществ продуцирующих его микроорганизмов. Он входит в виде коэнзима в состав ферментов, участвующих в синтезе нуклеотидов, т. е. в процессах, происходящих в организме в период интенсивного роста. В связи с этим становится понятным, почему при выращивании пропионовокислых бактерий образование и накопление витамина происходит параллельно накоплению бактериальной массы только в первые сутки развития культуры.

Получение витамина B₁₂ путем термофильного метанового брожения отходов спиртовой промышленности. В последние годы, помимо перечисленных выше способов получения витамина В₁₂ предложен метод, позволяющий использовать в качестве продуцентов термофильные метановые бактерии. Процесс брожения часто используют для обезвреживания сточных вод. Гнилостными бактериями осуществляется протеолиз белков сточных вод до аминокислот с последующим их дезаминированием. Образовавшиеся в результате этих реакций жирные кислоты сбраживаются метановыми бактериями. Метановые бактерии, как известно, представляют собой смесь различных культур (до 70 штаммов) и образуют, как его иногда называют, активный ил. Для получения витамина B₁₂ при метановом брожении может быть использована барда, поступающая с ацетоно-бутиловых заводов, а также паточная спиртовая барда, являющиеся промышленными отходами. Изложенный способ имеет важные преимущества по сравнению с другими способами ферментации витамина для кормовых целей. Метановое брожение барды позволяет, наряду с получением витамина В₁₂ и метана, значительно обезвредить сточные воды, сбрасываемые спиртовыми и ацетоновыми заводами, и тем самым улучшить санитарные показатели работы этих предприятий. Оно более экономично, так как не требует затрат на питательную среду (используются отходы); может идти в железных или железобетонных емкостях, вместо ферментеров из нержавеющей стали; не требует стерилизующих систем и расхода пара на стерилизацию среды. Процесс осуществляется непрерывным методом вместо периодического. В качестве побочного продукта получается значительное количество метана, который может быть использован как топливо.

Синтез антибиотиков

Антибиотик аурантин является продуктом биосинтеза Act. aurantiacus. Аурантин относится к многочисленной группе антибиотиков, известной под названием актиномицинов.

В настоящее время известно около 30 антибиотиков — представителей этой группы. Интерес к актиномицинам связан с их противоопухолевым действием, хотя имеющийся экспериментальный материал крайне противоречив. Молекулы их состоят из двух частей — гетероциклической и полипептидной. Гетероциклическая (хромофорная) часть является одинаковой у всех актиномицетов.

Аурантин не является индивидуальным веществом, а состоит по крайней мере из 4 компонентов, которые условно названы A1, А2, А3, А4. Отличаются они друг от друга последовательностью расположения и составом аминокислот в полипептидной цепи. Как отмечалось выше, актиномицины отличаются друг от друга по составу или расположению аминокислот пептидной цепочки. Состав и строение образующегося антибиотика зависит не только от специфических особенностей организма-продуцента, но и от условий, в которых происходит его культивирование. Например, состав образующейся смеси антибиотиков зависит от продолжительности ферментации. Изменить аминокислотный состав антибиотика могут присутствующие в среде аминокислоты. Применение в качестве ингредиентов среды аминокислот, которые не входят в молекулу, несколько угнетает общий синтез антибиотика и, кроме того, вызывает изменение в его составе. Большинство аминокислот не включается в молекулу антибиотика, оказывая косвенное влияние на ее структуру, вызывая изменения в соотношении фракций A1 и А2, т. е. влияют на интенсивность включения в молекулу изолейцина или валина.

Антибиотик флоримицин, известный также в литературе под названием биомицина, представляет собой полипептид основного характера. Наиболее широкое клиническое применение имеет сульфат флоримицина.

Механизм биосинтеза молекулы антибиотика неизвестен. Из испытанных источников углерода положительное влияние на синтез оказывали глюкоза, гидрол и крахмал. Сахароза и лактоза не использовались культурой. Глицерин и кашалотовый жир снижали уровень активности антибиотика в среде.

Весьма характерной особенностью продуцента флоримицина (штамм Act. floridae № 469) оказалось различное отношение к источникам азота в зависимости от источника углерода, присутствующего в среде, что в конечном итоге сказывается на содержании флоримицина в культуральной жидкости.

Из различных бактериальных культур получено несколько близких по строению антибиотиков, являющихся полипептидами.

В частности, к их числу относятся тироцидин и выделенный в 1942 г. советскими учеными Г. Ф. Гаузе и М. Г. Бражниковой из культуры Вас. brevis грамицидин С. Определение молекулярного веса антибиотика и изучение его химической структуры позволили сделать вывод о том, что грамицидин С представляет собой декапептид, в состав которого в определенной последовательности входят пять аминокислот, одна из которых — фенилаланин является D-изомером.

Большое влияние на рост и образование антибиотика Вас. brevis оказывает возраст посевного материала. Использование для заражения среды лишь молодой, находящейся в стадии логарифмического роста культуры, обеспечивает интенсивный синтез грамицидина.

В связи с механизмом биосинтеза полипептидных антибиотиков необходимо отметить факт возможной замены в молекуле тироцидина, близкого по строению к грамицидину, фенилаланина триптофаном и наоборот. Замена оказывается возможной, если создать в среде определенные соотношения между аминокислотами. Этот факт показывает, что последовательность аминокислот в полипептидах не находится под абсолютным и непосредственным генетическим контролем. Подобный характер замены аминокислот может свидетельствовать о низкой специфичности энзимов, участвующих в распознавании и включении аминокислот в определенные места полипептида тироцидина. Структурно родственные аминокислоты, такие, как фенилаланин, триптофан, тирозин, включаются на конкурентных условиях в зависимости от их доступности.

Среди антибиотиков, выделенных из актиномицетов, большую группу составляют полиеновые антибиотики.

Они слабо действуют на бактерии и обладают, как правило, значительной антибиотической активностью относительно грибов. Некоторые из полиеновых антибиотиков: нистатин, амфотерицин В, леворин, трихомицин, кандицидин — используются для лечения ряда заболеваний, вызванных дрожжами и грибами.

Все полиеновые антибиотики характеризуются наличием в молекулах сопряженных двойных связей и в зависимости от количества их разделяются по спектрам поглощения в ультрафиолетовой области. Антибиотики-тетраены содержат четыре сопряженные двойные связи, пентаены — пять, гексаены — шесть, гептаены — семь.

Выяснение структуры некоторых полиеновых антибиотиков (пимарицина, филиппина) показало, что они являются макроциклическими лактонами, к которым глюкозидной связью присоединены остатки аминосахаров.

Характерной особенностью полиеновых антибиотиков является их преимущественная внутриклеточная локализация. Содержание полиеновых антибиотиков в среде крайне незначительно. Поэтому при получении полиеновых антибиотиков их экстрагируют из мицелия.

Из полиеновых антибиотиков наибольшее распространение в СССР получили нистатин (фунгицидин) и леворин. Продуцентом нистатина является бактерии рода стремицеты - Streptomyces noursei.

Кроме нистатина, важное практическое значение имеет другой полиеновый антибиотик — леворин (26/1). Продуцентом его является бактерии рода актиномицеты - Actinomyces levoris.

Олеандомицин характеризуется наличием макроциклического лактонного кольца, а по своему химическому строению является гликозидом, обладающим основными свойствами. Олеандомицин состоит из двух сахаров — L-олеандрозы и аминосахара дезозамина, гликозидно связанных с лактоном олеандолидом. В молекуле олеандомицина содержится также эпоксидная группировка. Продуцентом антибиотика является культура Actinomyces antibioticus.

Эритромицин представляет собой продукт жизнедеятельности Act. erythreus. По химической природе он относится к группе антибиотиков, называемых макролидами. В настоящее время выделено три эритромицина А, В и С. В отличие от эритромицина А у эритромицина В у двенадцатого углеродного атома отсутствует гидроксильная группа, у эритромицина С — метоксильная группа кладинозы. По своей активности in vitro эритромицины В и С ниже, чем эритромицин А. Торговый препарат содержит все три типа эритромицина, с преобладанием эритромицина А.

Новобиоцин — антибиотик, относящийся к группе кислородсодержащих гетероциклических соединений. Продуцентами являются культуры Act. spheroides, Act. niveus.

Образование новобиоцина происходит при развитии актиномицета как на сложных средах неопределенного состава, где в качестве компонентов применяются соевая мука, кукурузный экстракт, ржаная сечка, барда, дрожжевой автолизат или другие вещества, так и на относительно простых по составу синтетических средах. В зависимости от разнообразных факторов среды актиномицет может синтезировать как биологически активное вещество (новобиоцин), так и биологически неактивные соединения (изоновобиоцин и дескарбамилновобиоцин), очень близкие по строению к новобиоцину. Механизм биогенеза антибиотика не установлен. Однако известно, что входящие в состав молекулы аминокумарин и производное пара-оксибензойной кислоты образуются из L-тирозина.

Неомицин является антибиотиком, синтезируемым Act. fradiae и некоторыми другими видами актиномицетов.

До недавнего времени неомицин имел в СССР три синонима: колимицин, мицерин и фрамицин. Однако после того как была доказана идентичность данных антибиотиков неомицину, вместо трех препаратов стали выпускать один под названием неомицин. В состав антибиотиков неомицинового комплекса входят: неомицин А (неамин), неомицин В и С. Все три вещества являются оптически активными основаниями. Неомицины В и С имеют аналогичный состав и являются изомерными веществами, отличающимися только пространственной конфигурацией. В состав неомицинов В и С входят: неомицин А (неомин), D-рибоза, диаминогексоза В или С. Act. fradiae в основном образует неомицины В и С, причем 90% составляет неомицин В.

Гризеофульвин синтезируется некоторыми грибами из рода Penicillium. В качестве продуцентов наиболее часто встречаются P. griseofulvum, P. nigricans, P. Janczewskii. Антибиотик имеет характерный спектр действия на различные грибы, в том числе патогенные.

Антибиотики хлортетрациклин и тетрациклин синтезируются одним и тем же продуцентом Act. aureofaciens.

Хлортетрациклин больше известен под торговым названием биомицин (СССР), ауреомицин и дуомицин (за рубежом). Тетрациклин за рубежом носит название тетрацин, стеклин, ахромицин, полициклин и т. д. В последнее время большое внимание привлекает диметил-хлортетрациклин, который получают применяя специальный мутантный штамм или регулируя процесс биосинтеза за счет введения в состав среды некоторых компонентов. Окситетрациклин известен также под названием террамицин. Продуцентом его является Act. rimosus.

Пеницилин синтезируется Penicillium chrysogenum.