Тема: Введення фібробластів людини у культуру

Мета: ознайомитися з методом отримання чистої культури фібробластів людини, вивчити методики культивування та пересіву (субкультивування) фіброфластів

Матеріали та обладнання: піпетки мірні від 1 до 10 мл, піпетки Пастера, пеніцилінові флакони, пробірки Лейтона, мірні флакони від середовища різних об'ємів, пробки гумові N 10, 12.5, 14.5, 24; скельця покривні для мікроскопії, що попередньо нарізані для розміщення їх у пеніцилінові флакони, пінцети очні анатомічні та хірургічні, затиск Кохера, бритва безпечна, препарувальні голка з нержавіючої сталі, гумова груша для роботи з піпетками (з одягненою гумовою трубкою), інвертований мікроскоп, ламінар–бокс, термостат.

 

У сучасній регенераційній медицині широко використовуються розробки в області нових клітинних біотехнологій, однією з яких є одержання і застосування фібробластів. Дана технологія, безсумнівно, має величезне соціально-економічне значення для існування суспільства.

Фібробласт (від «fibra» — «волокно», «blastos» — «паросток») — найбільш поширена і функціонально значуща клітина пухкої сполучної тканини. Ці клітини відносяться до лінії механоцитів, мають круглої або подовженої веретеноподібної формою з відростками і плоским овальним ядром, і присутні у стромі всіх без винятку органів. Головна функція фібробластів — участь у метаболізмі міжклітинної речовини. Стан і функція основних позаклітинних компонентів сполучної тканини, колагенових, еластичних і ретикулярних волокон і міжклітинного матриксу залежать від функціональної активності фібробластів. Фібробласти синтезують і виділяють у міжклітинний простір велику кількість біологічно активних речовин, серед яких можна виділити різні фактори росту (EGF — фактор росту епідермісу, регулює міграцію і проліферацію епідермальних клітин шкіри, FGF — фактор росту фібробластів, стимулює зростання всіх типів клітин і продукцію позаклітинного матриксу, KGF — фактор росту кератиноцитів та ін), компоненти позаклітинного матриксу (глікозаміноглікани, гіалуронова кислота, хондроітинсульфат) і ферменти. Цей процес відбувається безперервно, і завдяки цьому, міжклітинна речовина постійно оновлюється. Основними джерелами фібробластів є — дерма шкіри і післяродова плацента.

Дерма становить основу шкірного покриву, більшу частину якої займають фібробласти. З віком товщина дерми зменшується, знижується вміст вологи, у результаті шкіра втрачає пружність та еластичність. Внаслідок цього з'являються зморшки. Старіння шкіри на різних ділянках тіла протікає нерівномірно. Особливо швидко старіють відкриті ділянки та шкіра у місцях природних складок.

З віком кількість фібробластів у шкірі зменшується, і вони стають менш активні. Існує думка, що однією з основних причин старіння шкіри є зниження здатності фібробластів шкіри до поділу і зниження рівня синтетичної активності. Для корекції вікових змін шкіри на даний час використовуються найрізноманітніші методи (пілінги, шліфування, ліфтинг тощо) і препарати (токсин ботулізму, компоненти позаклітинного матриксу і сполучної тканини і т.д.). Багато з цих методів спрямовані на стимуляцію власних клітин шкіри, зокрема, фібробластів. Однак можна вирішити проблему і іншим чином — збільшити кількість фібробластів у шкірі за допомогою їх пересадки у ті ділянки шкіри, де це необхідно.

 

 

Рис. 8.1 Ріст фібробластів після введення до пошкодженої шкіри.

а) шкіра до введення фібробластів.

б) шкіра через місяць після введення фібробластів, які активно діляться і поступово заповнюють міжклітинний простір

в) шкіра через три місяці після введення фібробластів. Молоді клітини заповнюють всі міжклітинний простір вони активно продукують колаген та еластин.

Джерелом отримання фібробластів, крім дерми шкіри, може служити післяродова плацента, основу сполучнотканинного шару якої (строми, багатою гіалуронової кислотою), складають фібробласти, що лежать у мережі колагенових і ретикулярних волокон. Плацентарні фібробласти здійснюють синтез комплексу біологічно активних речовин — ростових факторів, імуностимуляторів, ферментів і інших активних пептидів, які беруть активну участь у процесах життєдіяльності клітин.

Свіжовиділені культури носять назву первинних культур до початку пасирування або субкультивування. У них найбільш повно представлені типи клітин тієї тканини, звідки вони були отримані. Пасирування забезпечує можливість продовження існування культури, можливість клонування, дослідження та збереження властивостей клітин. При цьому виходять більш однорідні популяції, а також втратити спеціалізовані клітини. Після декількох пересівань лінія клітин або гине, або трансформується і стає постійною клітинної лінією.

Пересівання виконують для отримання кількості клітин, достатнього для цитогенетичного або біохімічного дослідження, а також для кріоконсервації. Клітинний штам вважають сталим, якщо після пасирування протягом перших 5 пасажів приріст клітин на 3-4 добу після пересівання перевершує кількість посіяних мінімум удвічі, що дозволяє пересівати такі клітини 1:2 (з однієї посудини у дві). Після того, як первинна культура досягне стану моношару, вона може бути перенесена до іншої посудини для культивування після дисоціації клітин моношару трипсином та розведення, тобто пересіяна або субкультивована. Для суспензійних культур у разі субкультивування достатньо тільки розведення. Дисоціація клітин моношарової культури досягається промиванням моношару фосфатним сольовим буфером (ФСБ) або ФСБ з 1 мМ етилендіамінтетраацетатом (ЕДТА) і подальшою інкубацією з розчином трипсину (0,25%-ний неочищений або 0,01-0,025%-ний очищений) протягом 15 хв. Після цього трипсин видаляється, клітини суспендується в середовищі, визначають їх кількість і розсівають у нові флакони.

Поживне середовище для культивування фібробластів. Фібробласти успішно культивують на різних середовищах, але рекомендується використовувати наступний склад поживного середовища: середовище ІГЛа — 90-85%, сироватка великої рогатої худоби — 5-10%, пуповинна сироватка людини (фетальна сироватка) — 5%, глютамін — 150 мг на 500 мл готового середовища. Готове середовище та його компоненти рекомендується зберігати при 4^оС. При культивуванні експлантів рекомендується використовувати антибіотики (40–60 мкг канаміцину на 1 літр середовища).

Пуповинну сироватку (якщо немає готової) можна приготувати наступним способом: зібрати кров у пологовому відділенні (стерильні флакони підставляють під відрізаний кінець пуповини до народження плаценти), зберігати у холодильнику до утворення згустку. Після цього сироватку зливають в центрифужні склянки і центрифугують при 500 g 2 рази по 20 хв., освітлюють шляхом фільтрації через мембранні фільтри послідовно діаметром пір 0.85, 0.4, 0.3, 0.22 мкм, остання фільтрація — стерилізуюча, і проводиться у стерильних умовах. Стерильність отриманої сироватки перевіряють посівом на агар.

 

Порядок виконання роботи

Заняття 1

Отримання чистої культури фібробластів людини.

1. Взяття біопсії. Фібробласти можна отримувати з багатьох тканин і органів. Найпростіше — фібробласти дермального шару шкіри. Найбільш зручно брати біопсію з внутрішньої сторони передпліччя лівої руки (нижня третина). Шкіру дезінфікують 70% етиловим спиртом. Не рекомендується вживати інші дезінфікуючі розчини, так як у випадку проникнення в біоптат вони можуть надати токсичну дію. Після дезінфекції шкіру захоплюють очним хірургічним пінцетом, відтягують і відрізають шматочок шкіри безпосередньо під браншами пінцета. Не слід прагнути взяти глибокі шари шкіри. При правильно взятої біопсії, захоплюючої епідерміс і сосочковий шар шкіри, кровотеча мінімально. Відсікання краще проводити лезом безпечної бритви, стерилизованої (як і пінцет) шляхом занурення в етиловий спирт з подальшим підпалюванням. Відсічений шматочок занурюється у заздалегідь приготований пеніциліновий флакон із середовищем. На рану накладають бактерицидний пластир. Фрагмент шкіри може зберігатися у поживному середовищі при 4 ^оС протягом 3-4 діб без втрати фібробластами здатності до зростання.

2. Отримання експлантів. У стерильну чашку Петрі з краплею 0.25% розчину трипсину або поживного середовища поміщають фрагмент шкіри. Притримуючи пінцетом, нарізають на дрібні шматочки завбільшки з головку шпильки і менше стерильним лезом безпечної бритви, затиснутою в затиск Кохера або Пеана. За допомогою зігнутої препарувальної голки шматочки витягують з краплі і поміщають на покривне скло, що знаходиться у пеніциліновому флаконі або пробірці Лейтона. Укладені шматочки накривають іншим покривним склом, злегка притискаючи препарувальні голкою. Наливають у культуральну посудину поживне середовище так, щоб вона покрила верхнє скло. Покривні скельця із затиснутими між ними шматочками шкіри за допомогою пінцета кладуть на бічну стінку пеніцилінового флакону. Флакони щільно закривають пробкою і встановлюють на підставці під кутом приблизно 30°. Культури інкубують у термостаті при 37^оС. Протягом тижня стежать за кольором середовища. Зміна кольору індикатора до жовто-помаранчевому свідчить про хороший стан експланту.

Після одного тижня культивування щодня починають переглядати культуру під мікроскопом. Можна використовувати як інвертований, так і звичайний мікроскоп. В останньому випадку слід обережно повернути флакон, при цьому скло з культурою прилипають до бічної стінки флакона і можуть бути досліджені при малому збільшенні. Навколо шматочків спочатку з'являються поодинокі фібробласти, які помітні у вигляді довгих веретеноподібних клітин, або з'являється шар епітелію, навколишній фрагмент у вигляді "мереживного" ореолу. При появі зони виросту клітин слід змінити середовище. Коли клітини займуть весь простір між шматочками (це видно неозброєним оком або за допомогою лупи), їх пересівають.

 

Заняття 2

Субкультивування (пересів) фібробластів.

1. Обробка культури трипсином. Видаляють поживне середовище з культурального судини і наливають 2-3 мл підігрітого 0.25% розчину трипсину (або суміш версія-трипсин). Через 2 хвилини видаляють трипсин, залишивши його лише між скельцями. Інкубують в термостаті 15-20 хвилин при 37^оС. Хід тріпсінізаціі можна контролювати, переглядаючи культури під мікроскопом.

2. Посів клітін. Після закінчення тріпсінізаціі за допомогою препарувальні голки відокремлюють одне скло від іншого і за допомогою тонко відтягнутою піпетки змивають клітини невеликою кількістю середовища (1 мл). При цьому кілька разів пропускають через піпетку суспензію клітин і шматочки. Суспензію клітин переносять в пеніциліновий флакон і додають середу до 2-3 мл. Що залишилися в колишньому посудині шматочки знову укладають між двох покривних стекол і заливають середовищем. Від цих вдруге культивованих експлантів може бути отриманий другий "врожай" клітин.
Флакон з пересадженими зростаючими фібробластами переглядають щодоби під мікроскопом. Коли утворюється злився шар клітин, проводиться другий пересівання (зазвичай через 4-7 діб).

3. Контроль штамів.

Щоденний перегляд культуральних посудин для оцінки кольору середовища та її прозорості. Різка зміна кольору і поява муті може свідчити про бактеріальне або грибкове зараження. Якщо колір індикатора середовища не змінюється після пересівання або зсувається в бік малинового, це може бути пов'язано з відсутністю розмноження клітин, з недостатньою кількістю для даного обсягу або загибеллю. За допомогою інвертованого мікроскопа оцінюється морфологія клітин і шару в цілому.

У нормальних умовах фібробласти — веретеноподібні витягнуті клітини з прозорою цитоплазмою. Відсутність малюнка на субстраті (фібробласти володіють орієнтованим зростанням), поява зернистості у цитоплазмі, порожні місця в шарі клітин, розпластаність клітин свідчить про їх дегенерацію у результаті токсичних або інших шкідливих впливів. Невелику кількість середовища після кожного пересіву відливають для перевірки на стерильність, яку здійснюють шляхом посіву на агар.

 

Контрольні питання:

1. Які основні функції фібробластів у організмі людини?

2. Які біологічно активні речовини виділяє функціонуючий фібробласт.

3. Назвіть компоненти середовища, що використовуються для культивування фібробластів?

4. За якою процедурою забору та підготовки експланту для отримання культури фібробластів?

5. Як здійснюють процедуру субкультивування (пересіву) фібробластів?

6. Як проводиться мікроскопічне дослідження кілтин культури фібробластів?

7. Як здійснюють контроль штамів фібробластів у культурі?

 

 

Список рекомендованої літератури

 

Основна література:

1. Бутенко, Р. Г. Биология культивируемых клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. Монография / Р. Г. Бутенко.— М.: ФБК-Пресс, 1999. — 159 с.

2. Калинин, Ф. Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений / Ф. Л. Калинин и др. - К.: Наукова думка, 1980. – 488 с.

3. Мельничук, М. Д. Біотехнологія рослин / М. Д. Мельничук, Т. В. Новак, В. А. Кунах.- К.: Поліграф консалтинг, 2003. – 520 с.

4. Муромцев, Г. С. Основы сельскохозяйственной биотехнологии / Г. С. Муровцев и др. – М.: Агропромиздат, 1990. – 383 с.

5. Сассон, А. Биотехнология / А. Сассон. – М.: Мир, 1987. – 411 с.

6. Фрешни Р.Я. Культура животных клеток. Практическое руководство. – М.: Мир., 2010. – 750 с.

7. Фрешни Р. Культура животных клеток. Методы. – М.: Мир., 1989. – 333 с.

8. Манк М. Біологія развития млекопитающих. Методы. – М.: Мир., 1990. – 407 с.

9. Дьяконов Л. П., Глухов В. Ф., Поздняков А. А., Денисенко Г. Ф., Калмыкова Т. П. Культивирование клеток и тканей животных. - Ставрополь: Ставроп. Правда, 1988, 2 часть, 91 с.

10. Голубев Д. Б., Соминина А. А., Медведева М. Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. - Л.: Медицина, 1976. - 224 с.

Додаткова література:

1. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак. – М.: Мир, 2002. – 585 с.

2. Глазко, В. И. Словарь терминов по прикладной генетике и ДНК-технологиям / В. И. Глазко, Г. В. Глазко. − К.: Нора-принт, 1999. – 342 с.

3. Глазко, В. И., ДНК-технологии и биоинформатика в решении проблем биотехнологий млекопитающих/ В. И. Глазко, Е. В. Шульга, Т. Н. Дымань, Г. В. Глазко. − Белая церковь: Белоцерковский государственный аграрный университет, 2001. – 488 с.

4. Глеба, Ю. Ю. Слияние протопластов и генетическое конструирование высших растений /Ю. Ю. Глеба, К. М. Сытник. − К.: Наук. думка, 1982. – 104 с.

5. Кучук, Н. В. Генетическая инженерия высших растений / Н. В. Кучук. − К.: Наук. думка, 1997. – 152 с.

6. Маниатис, Т. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Є. Фриз, Дж. Сємбрук. − М.: Мир, 1990. – 479 с.

7. Пирузян, Э.С. Основы генетической инженерии растений / Э. С. Пирузян. − М.: Наука, 1988. – 304 с.

8. Рыбчин, В. Н. Основы генетической инженерии / В. Н. Рыбчин – СПб.: Изд-во СПбГТУ, 2002. – 522 с.

9. Санітарні норми та правила в Україні. – К.: КНТ, 2004. – 460 с.

10. Griffiths, A. J. F. Introduction to genetic analysis. 8^th edition / A. J. F. Griffiths, S. R. Wessler, R. C. Lewontin et al. - New York: W.H.Freeman and Company, 2005. - 782 p.

11. Животная клетка в культуре под. ред. Л. П. Дьяконова, В. И. Ситькова. – М.: 2000

 

Зміст

 

Вступ
Лабораторна робота №1. Організація лабораторії біотехнології рослин.
Лабораторна робота № 2. Приготування і стерилізація поживних середовищ.
Лабораторна робота №3. Стерилізація і посадка експлантатів на штучне поживне середовище.
Лабораторна робота №4. Аналіз культивування рослинних об’єктів in vitro.
Лабораторна робота № 5. Поняття про тканинне культивування
Лабораторна робота № 6. Поживні середовища, які використовують при клітинному клонуванні тварин.
Лабораторна робота № 7,8. Введення фібробластів людини у культуру
Список рекомендованої літератури