Определение концентрации органических веществ с помощью ферментов.

Использование ферментов в качестве реактивов позволяет определять концентрацию органических веществ с высокой точностью, так как ферменты обладают высокой чувствительностью и избирательностью к своим субстратам.

 

15. Основные принципы и методы энзимотерапии. Биохимические основы энзимотерапии: особенности применения, пути введения.

Энзимотерапия – применение ферментов животного, бактериального или растительного происхождения и регуляторов активности ферментов с лечебной целью.

Внедрению ферментных препаратов в современную клиническую практику способствовало развитие технологий получения обогащенных ферментами препаратов и очищенных ферментов.

В энзимотерапии существует насколько направлений:

1. Лекарственные препараты на основе ферментов. В качестве лекарственных препаратов наиболее широко используются гидролитические ферменты.

1) Протеолитические ферменты применяются при нарушении пищеварения. Например:

а) Экстракты слизистой оболочки желудка, основным действующим веществом которых является пепсин. Это препараты абомин и ацидинпепсин, их в основном используют для коррекции секреторной дисфункции желудка.

б) Панкреатические энзимы, представленные амилазой, липазой, трипсином и химотрипсином. Это препараты панкреатин, мезим-форте, панцитрат, креон, их используются для коррекции нарушений процесса пищеварения, а также для регуляции функций поджелудочной железы.

в) Комбинированные ферменты, содержащие панкреатин в комбинации с компонентами желчи, гемицеллюлозой. Это препараты дигестал, фестал, панзинорм-форте, энзистал. Их назначают при недостаточной внешнесекреторной функции поджелудочной железы в сочетании с патологией печени, желчевыводящей системы, при нарушении жевательной функции, малоподвижном образе жизни, кратковременных погрешностях в еде.

г) Растительные энзимы, представленные папаином, грибковой амилазой, протеазой, липазой и др. ферментами. Препараты пепфиз и ораза. Папаин и протеазы гидролизируют белки, грибковая амилаза - углеводы, липаза - жиры.

д) Дисахаридазы. Например, тилактаза - пищеварительный фермент представляющий собой лактазу, которая находится в щеточной кайме слизистой оболочки тощей кишки и проксимального отдела подвздошной кишки. Расщепляет лактозу на простые сахара.

2) Протеолитические препараты применяют местно, в виде аппликаций или орошений, при первичной обработке ран и ожогов. Гидролизуя белки некротизированных тканей, ферменты способствуют очищению раны, уменьшению воспаления и ускорению заживления.

Например, коллагеназа вызывает деструкцию коллагена при этом жизнеспособные мышцы, грануляционная ткань и эпителий остаются интактными. При гнойных ранах коллагеназа способствует быстрому очищению от нежизнеспособных тканей и экссудата, более раннему появлению грануляционной ткани и эпителизации, предупреждает развитие грубых (типа келоидных) рубцов, способствует сохранению функции суставов.

3) Гиалуронидазы – (лидаза, ронидаза) – ферменты, специфическим субстратом которых является гиалуронованная кислота, основа межклеточного матрикса соединительной ткани. Показателями к их применению являются рубцы после ожогов и операций, гематомы, контрактуры суставов и т.д. Лечебный эффект проявляется размягчением рубцов, рассасыванием гематом, появлением подвижности в суставах.

4) Протеолитические ферменты стрептокиназу, урокиназу применяют для предотвращения и лечения тромбозов, эмболии, инфаркта миокарда, закупорки сосудов сетчатки глаза. Стрептокиназа и урокиназа способствует превращению плазминогена в плазмин, который лизирует тромб.

5) Нуклеазы (ДНК-аза, РНК-аза) используют при лечении некоторых вирусных заболеваний (герпес, аденовирусный конъюктивит, вирусный менингит, ОРВИ и др.). Фермент разрушает ДНК вируса, не повреждая вместе с тем ДНК клеток макроорганизма. α-ДНКаза в препарате пульмозим используется как муколитик, она расщепляет внеклеточную ДНК, содержащуюся в большом количестве в вязком бронхиальном секрете.

6) Бактериолитические ферменты. Препарат «лизоамидаза» содержит комплекс ферментов: мурамидазу, амидазу, пептидазу и высокомолекулярный полисахарид. Препарат обладает наибольшей бактерицидной активностью по отношению к грамположительным бактериям: стафилакоккам, стрептококкам, а также менингококкам, гонококкам. Особенность, препарат показывает высокую бактерицидную эффективность вне зависимости от устойчивости бактерий к действию антибиотиков.

Системная энзимотерапия – использование полиферментных препаратов широкого спектра действия. Полиферментные препараты представляют собой эффективное противовоспалительное, противоотечное, фибринолитическое, иммуномодулирующее и вторично анальгетическое средство широкого спектра показаний. Препараты вобэнзим, вобэмугос, флогэнзим применяются в области травматологии, хирургии, спортивной медицины, ревматологии, ангиологии и гинекологии.

Препарат вобэнзим кроме панкреатина содержит папаин (из растения Carica Papaya), бромелаин (из ананаса обыкновенного) и рутозид (группа витамина Р). Наряду с выраженными ферментативными свойствами обладает противовоспалительным, противоотечным, фибринолитическим и вторичноанальгезирующим действием. Используется при панкреатите, язвенном колите, болезни Крона, травмах, аутоиммунных онкологических, урологических, гинекологических заболеваниях.

Флогэнзим представляет собой комбинацию ферментов (бромелаин и трипсин) и рутина. Бромелаин и трипсин способствуют быстрому расщеплению клеточных фрагментов и метаболических продуктов воспалительного процесса, рутин восстанавливает проницаемость стенок сосудов, что приводит к уменьшению отеков и гематом. Флогэнзим оказывает противовоспалительное, фибринолитическое, антиагрегантное и противоотечное действие.

Применение ферментов в терапии ограничивается их лабильностью, нежелательными антигенными свойствами, трудностями адресной доставки к пораженным органам и тканям. Этих недостатков лишены иммобилизированныеферменты – энзимные препараты, соединенные с полимерной матрицей, либо включенные в липосомы или тени эритроцитов. Например, прозефим (комплекс бактериальных протеаз, иммобилизированных на аминоцеллюлозе), применяемый при гнойно-некротических процессах, обладает пролонгированным лечебным эффектом. Он способен гидролизовать денатурированный белок непрерывно свыше 10 суток, сохраняя по истечении этого срока до 90% исходной активности.

Иммобилизированные ферменты применяют для экстракорпоральной перфузии крови типа «искусственная почка». Такое лечение полностью исключает нежелательные воздействия на организм чужеродного белка и может проводиться в течение длительного времени.

2. Лекарственные препараты на основе коферментов и витаминов. Коферментные препараты: кокарбоксилаза, рибофлавина мононуклеотид, флавинат, пиридоксальфосфат, кобамамид используют для усиления активности ряда ферментов.

3. Лекарственные препараты на основе ингибиторов и активаторов ферментов.

· Препараты пантрипин, ингитрил, контрика ингибируютпротеолитических ферменты поджелудочной железы, которые активируются в протоках при воспалении, и применяются для лечения острых панкреатитов.

· Антихолинэстеразные препараты, ингибиторы моноаминоксидазы применяются как психотропные средства.

· ингибиторы карбоангидразы используются в качестве диуретиков.

· Аллопуринол используют при гиперурикемии для ингибирования фермента ксантиноксидазы.

· Действие тетурама при лечении алкоголизма связано с угнетением им фермента ацетальдегидоксидазы.

 

16. Биологическое окисление (БО) совокупность окислительно-восстановительных реакций, которые протекают во всех живых клетках.

Субстрат БО – вещество, способное отдавать электрон. (Любые вещества, способные вступать в реакции окисления).

Биохимик В.И.Палладин создал теорию дыхания, как совокупности ферментативных процессов. Он предположил, что окисление субстратов может происходить в 2 фазы:

1). Анаэробная фаза. В этой фазе особые вещества хромогены (R) отщепляют Н от субстратов и восстанавливаются (RH₂).

2). Аэробная фаза. Восстановленные хромогены RH₂ передают Н на О₂.

Субстрат БО - в-во, способное отдавать электроны (в-ва, способные вступать в реакции окисления).

Пути использования кислорода в клетке

В настоящее время выделено 4 основные пути использования кислорода в организме:

1. Оксидазный путь - окислительное фосфорилирование. Протекает в митохондриях, является основным источником АТФ в аэробных тканях. Потребляет 90% кислорода.

2. Монооксигеназный путь. Обеспечивает включение 1 атома кислорода в молекулу субстрата. Используется для синтеза новых веществ (стероидные гормоны), обезвреживания ксенобиотиков и токсических продуктов обмена в митохондриях и ЭПР.

3. Диоксигеназный путь. Обеспечивает включение молекулы кислорода в молекулу субстрата. Используется для деградации АК и синтеза новых веществ.

4. Пероксидазный и радикальный пути. Кислород участвует в образовании перекисей и активных радикалов, которые необходимы в пероксисомах для внутриклеточного пищеварения, разрушения макрофагами бактерий, вирусов, регуляции метаболизма и т.д. Перекиси и активные кислородные радикалы оказывают также повреждающее воздействие на структуры клеток и тканей, активируя ПОЛ. Разрушение перекисей и инактивация свободных радикалов осуществляется с помощью ферментативной и неферментативной антиокидантной системы.

17. Оксидазный путь потребления кислорода протекает в митохондриях, потребляет 90% О2 и обеспечивает процесс окислительного фосфорилирования.

Окислительным фосфорилированием называют синтез АТФ из АДФ и Н3РО4 за счет энергии движении электронов по дыхательной цепи.

Окислительное фосфорилирование является основным источником АТФ в аэробных клетках.

МЕХАНИЗМ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ

Окислительное фосфорилирование состоит из процессов окисления и фосфорилирования, которые между собой сопряжены.

Процесс окисления происходит при движении электронов по дыхательной цепи от субстратов тканевого дыхания на кислород. Дыхательная цепь окислительного фосфорилирования состоит из 4 белковых комплексов, встроенных во внутреннюю мембрану митохондрий и небольших подвижных молекул убихинона и цитохрома С, которые циркулируют в липидном слое мембраны между белковыми комплексами.

Комплекс I – НАДН2 дегидрогеназный комплекс

Комплекс II – СДГ.

Комплекс III – Комплекс b

Комплекс IV – Цитохромоксидазный комплекс

Коэнзим Q (убихинон

Компоненты дыхательной цепи располагаются в мембране в порядке повышения их редокс-потенциала. При переходе е- от комплекса с низким редокс-потенциалом к комплексу с более высоким редокс-потенциалом происходит выделение свободной энергии. При окислении 1 НАДН2 выделяется 220 кДж/моль свободной энергии.

I, III и IV комплексы дыхательной цепи используют 65-70% этой свободной энергии для переноса Н+ из матрикса митохондрий в межмембранное пространство, 30-35% свободной энергии рассеивается в виде тепла.

18. Этапы унифицирования энергии пищевых веществ и образования субстратов тканевого дыхания

Образование субстратов тканевого дыхания осуществляется в несколько этапов:

· При переваривании в ЖКТ происходит гидролиз полимеров (белков, полисахаридов) и ТГ до мономеров, которые потом всасывающихся в кровь и включающихся в промежуточный обмен.

· В ходе катаболизма моносахара, жирные кислоты и аминокислоты превращаются в универсальное вещество - Ацетил-КоА (исключение некоторые АК).

· Ацетил-КоА поступает в ЦТК, где из него в последовательных реакциях образуются субстраты тканевого дыхания: изоцитрат, α-КГ, сукцинат и малат.

· Окисление тканевого дыхания сопровождается восстановлением коферментов НАДН2 и ФАДН2, которые затем отдают протоны в редокс-цепь окислительного фосфорилирования.

19. Митохондрии - органеллы клеток. Они имеют 2 мембраны наружную гладкую и внутреннюю с многочисленными складками – кристами, внутреннее пространство митохондрий заполнено матриксом.

Метаболические и гомеостатические функции митохондрий

В митохондриях происходит: синтез АТФ и теплопродукция в реакция окислительного фосфорилирования; β-окисления жирных кислот; реакции ЦТК, через ЦТК протекают некоторые реакции глюконеогенеза, переаминирования, дезаминирования, липогенеза и синтеза гема, осуществляется интеграция белкового, липидного и углеводного обмена.

Митохондрии имеют наружную мембрану, проницаемую для большинства метаболитов, и избирательно проницаемую внутреннюю мембрану с множеством складок (крист), выступающих в сторону матрикса (внутреннего пространства митохондрий). Наружная мембрана может быть удалена путем обработки дигитонином; она характеризуется наличием моноаминоксидазы и некоторых других ферментов (например, ацил-КоА-синтетазы, глицерофосфат- ацилтрансферазы, моноацилглицерофосфат-ацилтрансферазы, фосфолипазы А2). В межмембранном пространстве находятся аденилаткиназа и креатинкиназа. Во внутренней мембране локализован фосфолипид кардиолипин. В матриксе находятся растворимые ферменты цикла лимонной кислоты и ферменты (-окисления жирных кислот, в связи с этим возникает необходимость в механизмах транспорта метаболитов и нуклеотидов через внутреннюю мембрану. Сукцинатдегидрогеназа локализована на внутренней поверхности внутренней митохондриальной мембраны, где она передает восстановительные эквиваленты дыхательной цепи на уровне убихинона (минуя первую окислительно- восстановительную петлю). 3-гидроксибутиратдегид рогеназа локализована на матриксной стороне внутренней митохондриальной мембраны. Глицерол-3-фосфат- дегидрогеназа находится на наружной поверхности внутренней мембраны, где она участвует в функционировании глицерофосфатного челночного механизма.

20. Цикл Кребса

ЦТК является процессом окисления АцетилКоА - универсального продукта катаболизма углеводов, жиров и белков. ЦТК протекает в митохондриях с участием 8 ферментов, которые локализованы в матриксе в свободном состоянии, или на внутренней поверхности внутренней мембраны. В ЦТК участвуют 5 витаминов В1, В2, РР, пантотеновая кислота и липоевая кислота в виде коферментов тиаминпирофосфата, ФАД, НАД+, КоА и липоата.

Основной функции ЦТК является образование водородных эквивалентов, которые в цепи окислительного фосфорилирования обеспечивают синтез макроэргических соединений. Кроме того, ЦТК выполняет ведущую роль в процессах глюконеогенеза, переаминирования, дезаминирования АК, липогенеза и синтеза гема. Интегрирует все виды обмена веществ.

Регуляция ЦТК. Осуществляется с участием 4 регуляторных ферментов: цитратсинтазы, изоцитрат ДГ, α-КГ ДГ и СДГ. ЦТК ингибируется в основном НАДН2 и АТФ, которые являются продуктами ЦТК и цепи окислительного фосфорилирования. Активируют ЦТК в основном НАД+ и АДФ.

Реакции ЦТК

1). Цитратсинтаза локализуется в матриксе митохондрий, ее активируют ЩУК, НАД+; ингибируют АТФ, НАДН2, Сукцинил-КоА, цитрат.

2). Аконитаза локализуется в матриксе митохондрий.

3). Окислительно-восстановительная реакция, самая медленная в ЦТК.

Изоцитратдегидрогеназа локализуется в матриксе митохондрий, ее активируют АМФ, Са2+, АДФ, НАД+; ингибируют АТФ, НАДН2.

4). Окислительно-восстановительная реакция.

α-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс состоит из 3 ферментов и содержит 5 коферментов: тиаминдифосфат, кофермент А, липоевая кислота, НАД+, ФАД.

α-КГ ДГ активируется Са2+, ингибируется сукцинил-КоА, АТФ, НАДН2.

5). Реакция субстратного фосфорилирования

6). Окислительно-восстановительная реакция.

Сукцинатдегидрогеназа, флавопротеин содержащий Fe2S2, связана с внутренней мембраной митохондрии. СДГ ингибирует ЩУК и Сукцинил-КоА,

7). Фумараза локализуется в матриксе митохондрий.

8). Окислительно-восстановительная реакция.

Малат ДГ локализуется в матриксе митохондрий.

Образовавшиеся молекулы ЩУК реагируют с новой молекулой Ацетил-КоА и цикл повторяется вновь.

Энергетический баланс одного оборота ЦТК

В 4 окислительно-восстановительных реакциях ЦТК образуются 3 НАДН2 и 1 ФАДН2, которые направляются далее в дыхательную цепь окислительного фосфорилирования. В процессе окислительного фосфорилирования ДЦ из 1 НАДН2 образуется 3 АТФ, из 1 ФАДН2 - 2 АТФ. Из 1 ГТФ, образующейся в ЦТК за счет субстратного фосфорилирования, синтезируется 1 АТФ. Таким образом, за 1 цикл ЦТК из 3 НАДН2, 1 ФАДН2 и 1 ГТФ получается 12 АТФ.

Коферменты и субстраты цикла Кребса – лекарственные препараты метаболической терапии.

Препарат «Коэнзим композитум». Показания:

Коррекция энергетического метаболизма при:

длительной поддерживающей терапии больных: ─ тяжелыми острыми воспалительными заболеваниями; ─ хроническими воспалительными заболеваниями;

Фармакологические свойства:

- энерготропное (регуляционное действие на работу внутриклеточных ферментных систем на уровне цикла

Кребса и электронно-транспортной цепи, что сопровождается синтезом основного количества АТФ);

- антигипоксическое; - антиоксидантное; - оптимизация витаминного и минерального обмена.

Компоненты:

- витамины: С, В1, В2, В6, РР - промежуточные катализаторы цикла Кребса: аконитовая, лимонная, яблочная, янтарная, фумаровая кислоты -субстраты -коферменты, растительные и минеральные компоненты