Извлечение и хранение эмбрионов

У коров-доноров на 6-7 день после осеменения осторожной пальпацией через прямую кишку подсчитывают число желтых тел, определяют степень их развития. Вымывают при наличии не менее 3-х желтых тел.

Извлечение эмбрионов возможно с 5-го по 10-й день после осеменения, наилучший срок – 7-8 день. По данным Хаслера более позднее извлечение эмбрионов (9-11 день) снижает процент стельности на 11-15%.

До середины 70-х годов эмбрионы извлекали хирургическим путем. Следовало несколько оперативных приемов: по белой линии живота, в области голодной ямки (слева или справа), через верхний свод влагалища.

Достоинство хирургического метода состоит в том, что донор обездвижен, манипуляции в матке проводятся под контролем зрения, достигается полное извлечение эмбрионов.

Недостатки:

1) нельзя использовать доноров многократно в связи с образованием спаек, рубцов в половых органах

2) метод трудоемкий и дорогостоящий, требует условий клиники

3) операция на лактирующей корове сопряжена со значительными потерями продукции.

Нехирургический метод (вымывание) предложен в середине 70-х годов (Р. Елдсен и Я. Хаслер) с использованием 2 и 3-х канального катетера Фоллея.

Вымывание можно проводить непосредственно в условиях животноводческой фермы.

– донора выдерживают на голодной диете 12 часов

– животное фиксируют (делают низкую эпидуральную анестезию (2-3 хвост.позвонки 5 мл – 2%новок.)

– наружные половые органы моют с мылом, дезинфицируют «Септонексом»

– катетер Фоллея стерилизуют, под контролем руки (находящейся в прямой кишке) вводят в рог матки до его верхушки. Шприцем заполняем воздухом баллон манжету, этим ограничиваем промывную полость.

– разовым шприцом вводим 40-50 мл жидкости (фосфатный буфер Дюльбекко). Рог осторожно массируют, чтобы отделить эмбрион от его стенок. Промывную жидкость отсасывают шприцом в стерильный флакон. Промывают 4-7 раз (200-400 мл жидкости)

– после промывания в полость матки вводят антибиотики

Применяя данную технологию, обычно получают 5-7 эмбрионов (в США – 7,4) на одно вымывание.

В Северо-Кавказском НИИ животноводства В.П. Белевич (1986) сконструировал безманжетный одноканальный катетер (извлекает 74-76% всех эмбрионов). В 1986 г.– Хабибулин с соавторами применил замкнутую гидростатическую систему и четырехходового крана.

Поиск и оценка эмбрионов – промывную жидкость отстаивают в термостате при +37⁰ (30-40мин)

– нижний слой (100мл) разливают в чашки Петри по100 мл и ведут поиск эмбрионов под стереоскопическим микроскопом МБС при 25 кратном увеличении. Эмбрионы автоматической пипеткой переносят в чашки Петри по 40 мл и определяют стадию развития эмбриона.

Морула – 5 дней

Компактная морула – 6

Ранняя бластоциста – 7

Бластоциста – 7

Расширенная бластоциста – 8

Вылупленная бластоциста – 9

Большинство эмбрионов полученных от одного донора должны находиться на одинаковой стадии развития.

Так, 8-ми дневный эмбрион должен быть – компактным, правильной сферической формы, диаметром 120-200 мк с хорошо выраженным трофобластом, иметь одинаковые бластомеры без признаков их дегенерации. Различают четыре категории качества.

Влияние качества эмбрионов на их приживаемость (по Р. Вагнеру, 1987г.)

Качество	Число эмбриопересадок	Получено беременностей
число	%
отличное
хорошее
удовлетворительное
плохое

Вопрос о пригодности удовлетворительных по качеству эмбрионов решают после 12-24 часов культивирования при +37⁰С. Эмбрионы плохого качества бракуют.

Хранение эмбрионов

После оценки жизнеспособности эмбрионов их дважды промывают в среде Дюльбекко +АБ, засасывают в минипайету вместе с небольшим количеством среды. Для пересадки используют в первые 2-4 ч. после извлечения из половых путей донора. Необходимость сохранения жизнеспособности эмбрионов более продолжительное время возникает в случаях:

– отсутствие достаточного количества реципиентов

– сомнительное качество вымытых эмбрионов

– создание банка эмбрионов (долгосрочные селекционные программы)

– обмен генофондом между странами

Существует два способа хранения эмбрионов:

а) кратковременное – в организме, средах

б) долговременное – в сжиженных газах

Кратковременное

1) Культивирование эмбрионов в среде ТСМ 199 с добавлением 20% эмбриональной сыворотки или сыворотки крови оленя. Хранят при t +37⁰С, 24-48 часа. При снижении температуры до +10⁰С можно продлить срок до 5-6 суток.

2) На протяжении 3-4 суток эмбрионы можно хранить в яйцеводах крольчих (выживаемость 73%).

Долговременное

Впервые осуществили Уилрадем, Полдж и Роусон в 1978 г. Технологию усовершенствовал Лейбо (1984). В нашей стране начали заниматься этой проблемой в 1979 г.

Существует два способа глубокого замораживания: ступенчатое охлаждение и одномоментное (витрификация).

а) При замораживании по первому способу эмбрионы (отличного и хорошего качества) последовательно проводят через растворы криопротектора (глицерин) возрастающих концентраций. Затем переносят в ампулы, герметизируют и помещают в камеры для замораживания, где охлаждают постепенно: – до – 7⁰С в режиме 1⁰С/мин

– до – 28-35⁰С – 0,3⁰С/мин и затем уменьшают до 0,1⁰С/мин

б) Быстрое, одномоментное замораживание (витрификация) разработал А. Массип в 1987 г. Это возможно при высокой концентрации криопротектора и быстром охлаждении. Используют полипропиленовые соломинки (пайеты) емкостью до 0,25 мл. В пайету засасывают – р-р сахарозы – воздух, – р-р глицерина с эмбрионом – воздух – р-р сахарозы. Концы запаивают. Эквилибрируют – 5 мин в парах жидкого азота – погружают в азот.

Идентификация пола

Перед закладкой на хранение эмбрионов можно определить пол эмбриона.

1. Цитологический метод – из морулы или бластоцисты брали часть бластомеров для определения половых хромосом. Этот метод снижал жизнеспособность эмбрионов.

2. Иммунологический метод – основан на том, что клетки самца имеют специфический антиген, обозначенный буквами Н – Υ. Он может быть обнаружен иммунофлюоресценцией, точностью до 90%.