Постановка полимеразной цепной реакции с детекцией продуктов амплификации электрофореза (Перенков А. Д. и др., 2015)

Ход работы:

1. Выделение и очистка ДНК – один из важнейших этапов секвенирования, т.к. качество и чистота препарата ДНК определяли успешный исход секвенирования. Проводили процедуру экстракции ДНК с использованием коммерческого набора реагентов согласно инструкции производителя.

2. Оценивали качество (отсутствие неспецифических фрагментов ДНК) и относительное количество (яркость светящейся полосы) очищенной ДНК методом электрофореза, внося в лунки агарозного геля индивидуальными наконечниками по 5 мкл препарата ДНК.

Терминирующая реакция

Проводили ПЦР в объеме 10 мкл согласно общим принципам постановки ПЦР, исключение составляет использование в одной реакции только одного праймера, в одноразовых пробирках объемом 0,2 мл в программируемом амплификаторе с термостатируемой крышкой.

1. Используя индивидуальные наконечники для каждого компонента реакции, собирали смесь в отдельной пробирке, за исключением препарата ДНК, из расчета на одну пробу:

Таблица 5

Расчет реагентов для смеси

* BigDye® Terminator v3.1 Ready Reaction Mix следует держать в темноте, т.к. он содержит ддНТФ, помеченные флуоресцентными красителями.

2. Аккуратно перемешивали собранную смесь на вортексе и кратковременно центрифугировали (5 сек.).

3. В одноразовые пробирки вносили по 5 мкл реакционной смеси, закрывали крышки и маркировали.

4. Используя отдельные наконечники для каждого образца, в реакционную смесь вносили 5 мкл препарата ДНК.

5. Перемешивали компоненты на вортексе и кратковременно центрифугировали (5 сек.).

6. Помещали пробирки в программируемый амплификатор с термостатируемой крышкой и проводили 25 циклов амплификации ДНК по следующей программе (7):

96^оС – 5 мин.

96^оС – 10 сек.

50^оС – 5 сек. 25 циклов (7)

60^оС – 4 мин.

72^оС – 7 мин.

4^оС – ∞

7. Продукты секвенирующей ПЦР использовали для последующей очистки меченных флуоресцентными красителями фрагментов ДНК.

Очистка ДНК

1. В штатив расставляли пробирки объемом 1,5 мл в количестве равном количеству секвенируемых образцов, и маркировали их.

2. Использовали отдельный для каждого компонента наконечник, в пробирку вносили 2 мкл 3М ацетата натрия и 50 мкл изопропанола.

3. Используя индивидуальный для каждого образца наконечник, переносили в пробирку с реакционной смесью весь объем ПЦР-продукта (10 мкл).

4. Перемешивали компоненты на вортексе и центрифугировали 15 мин. при 14,5 тыс. об/мин

5. Аккуратно удаляли супернатант, используя автоматический дозатор и отдельный наконечник для каждого образца.

6. В пробирки вносили по 250 мкл 70% этанола, закрывали крышки и центрифугировали 5 мин. при 14,5 тыс. об/мин

7. Аккуратно удаляли супернатант, используя автоматический дозатор и отдельный наконечник для каждого образца.

8. Подсушивали осадок до исчезновения запаха спирта (10-15 мин.), оставив пробирки в штативе или в термостате при 37оС, при этом крышки пробирок были открыты.

9. В пробирки вносили 20 мкл формамида и закрывали крышки.

10. Перемешивали компоненты на вортексе и кратковременно центрифугировали (5 сек.).

11. Помещали пробирки в термостат, предварительно нагретый до 95оС, и инкубировали 5 мин.

12. Проводили секвенирование денатурированных фрагментов ДНК в приборе ABI Prism 3130 согласно инструкции производителя.

Анализ результатов секвенирования

1. Полученную нуклеотидную последовательность проверяли на правильность считывания прибором нуклеотидов (инсерции/делеции, наличие гетерозигот). Для этого анализировали электрофореграмму сначало в ручном режиме, затем с использованием возможностей сети Интернет.

2. В компьютер загружали страницу официального сайта BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, поисковый инструмент базового локального выравнивания) - семейство компьютерных программ, служащих для поиска гомологичных нуклеотидных или аминокислотных последовательностей нуклеиновых кислот и белков, соответственно (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

3. Выбирали программы анализа нуклеотидных последовательностей -nucleotide blast.

4. В окно Enter Query Sequence вставляли исследуемую нуклеотидную последовательность.

5. Нажимали BLAST.

6. Просматривали отчет BLAST, где указывались близкородственные последовательности в графическом виде и в формате таблицы. В строках таблицы указывались найденные гомологичные последовательности, в столбцах – процент их идентичности, рассчитанные значения, дающие оценку статистической значимости полученных результатов, и номер последовательности в GenBank. Проводили детальный анализ сравниваемых последовательностей, переходя в раздел Alignments, где показано выравнивание исследуемой нуклеотидной последовательности (Query) с гомологичной (Sbjct), идентичность последовательностей и наличие пробелов (gaps) в последовательностях.

Дальнейший анализ обнаруженных генетических изменений проводили с использованием баз данных, находящихся в свободном доступе в сети Интернет. Например, в молекулярно-генетической диагностике, в определении наследственных нарушений, а также в научных исследованиях частот аллельных вариантов и описания зависимости генотип-фенотип наиболее часто использовали следующие базы данных: GeneTests (www.genetests.org); Online Mendelian Inheritance in Man (www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim); locus specific databases (LSDBs) расположенной на сайте Human Genome Variation Society (HGVS) (www.HGVS.org/dblist.html); Database E of Chromosome Imbalance and Phenotype in Humans с использованием Ensembl Resources (http://decipher.sanger.ac.uk); EntrezGene (ncbi.nlm.nih.gov/gene); dbGap: Database of Genotype and Phenotype (ncbi.nlm.nih.gov/dbgap); и Human Gene Mutation Database HGMD ® (http://www.hgmd.org).

Выводы

В результате проделанной работы были сделаны следующие выводы:

1. Амплификацирована генетическая конструкция pPICZA-ScFv-NSP4 в клетках E.coli и ее выделение.

2. Получен рекомбинантный белок ScFv-NSP4 и детектирован.

На основании данных выводов можно поставить следующие задачи для реализации дальнейшей работы:

1. Очистка рекомбинантного белка ScFv-NSP4 из клеток Pichia Pastoris.

2. Введение мышам данного рекомбинантного белка с целью терапевтического воздествия на злокачественную опухоль животного.