Работа 17. Получение амилазы из солода и обнаружение ее действия

ХОД РАБОТЫ

Половину чайной ложки солода растирают в ступке, приливают около 20 мл теплой воды, смесь взбалтывают и оставляют на 10 минут. Затем отфильтровывают через бумажный фильтр в коническую колбу. Первые порции мутного фильтрата сливают обратно на фильтр. В фильтрат перейдет фермент амилаза, расщепляющий крахмал.

Наиболее чувствительной цветной реакцией на крахмал и продукты его гидролиза является йодная проба. Для обнаружения действия амилазы берут слабый раствор йода, который готовят следующим образом: небольшое количество концентрированного раствора йода в йодистом калии приливают в колбочку и разбавляют дистиллированной водой до появления светло-желтой окраски. Приготовленный раствор разливают в два ряда пробирок (всего 20-24) по 5 мл. Берут 2 конические колбочки, наливают в них по 30 мл раствора крахмала, добавляют по 5 мл отфильтрованной солодовой вытяжки с амилазой. Одну колбочку оставляют на столе при комнатной температуре, а другую помещают в водяную баню, нагретую до 55°С. Во избежание разрушения фермента не следует допускать перегрева бани.

В первую пробирку каждого ряда приливают 1 мл через каждые 2 минуты и вносят в очередную пробирку с раствором йода соответствующего ряда. Йод будет окрашивать крахмал и продукты его гидролиза в разные цвета: в типично синий, характерный для неизмененного крахмала, затем в сине-фиолетовый и темно-фиолетовый (амилодекстрины), красно-бурый (эритродекстрины) и желтый (ахродекстрины). Получается как бы цветная шкала постепенного гидролиза крахмала.

Когда внесенная проба (1 мл) уже не будет изменять светло-желтой окраской йода, это указывает на окончание гидролиза крахмала, из колбочки берут 2 мл раствора, переносят в пробирку и добавляют такое же количество фелинговой жидкости. Образование кирпичного красного осадка закиси меди после кипячения содержимого пробирки свидетельствует о присутствии низкомолекулярных восстанавливающих (редуцирующих) сахаров в испытуемом растворе появившихся в результате гидролиза крахмала.

Аналогичную реакцию проводят с исходным крахмалом.
Время окончания его гидролиза в первой и во второй
колбочках дает возможность судить о скорости процессов при
разных температурах. Результаты опыта учитывают по схеме:

 

Условия опыта

Окраска раствора йода в пробирках

Начало опыта

Окончание опыта

Время гидролиза

Комнатная температура

Температура 55°С

 

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) солод; 2) 2%-ный раствор крахмала; 3) раствор йода в йодистом калии; 4) пипетки на 1 мл, 20 мл; 5) термометр; 6) штатив с пробирками; 7) воронки; 8) фильтры; 9) жидкость Фелинга; 10) водяная баня.

 

Работа 18. Выделение β-фруктофуранозидазы из дрожжей и ферментативный гидролиз сахарозы

Данный фермент (прежнее название инвертаза или сахараза) разлагает сахарозу на фруктозу и глюкозу (инвертный сахар):

 

С₁₂Н₂₂О₁₁ + Н₂О = С₆Н₁₂О₆ + С₆Н₁₂О₆

сахароза глюкоза фруктоза

 

ХОД РАБОТЫ

2-3 г прессованных дрожжей смешивают с 2-3 г кварцевого песка, доливают 5 мл воды и тщательно растирают в фарфоровой ступке. Затем приливают еще 15 мл воды, нагретой до 40°С, и продолжают растирание в течение 10 минут. Раствор профильтровывают через складчатый фильтр. Первые порции мутного фильтрата сливают снова на фильтр. На фильтре будет находиться β-фруктофуранозидаза, расщепляющая сахарозу на глюкозу и фруктозу.

В три пробирки помещают по 5 мл 2%-ного раствора сахарозы. Одну оставляют для контроля, во вторую приливают 1 мл фильтрата, в третью также 1 мл фильтрата, но предварительно прокипяченного. Пробирки ставят в водяную баню с температурой 40°С. Через 15-20 минут в них добавляют 5 мл реактива Фелинга, а затем содержимое следует хорошо прокипятить на горелке. В присутствии восстанавливающих сахароз выпадает кирпично-красный осадок закиси меди (Сu₂О).

На основании результатов реакции делают заключение о
действии фермента β-фруктофуранозидазы и о влиянии на
его активность высокой температуры.

Результаты записывают по схеме:

 

 

 

 

 

Вариант	Состав смеси в пробирке, мл	Результат
сахароза, 2%-ный р-р	фильтрат - носитель фермента
без кипячения	после кипячения
		-	-
			-
		-

 

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) дрожжи прессованные; 2) ступка; 3) кварцевый песок; 4) воронки; 5) штатив с пробирками; 6) водяная баня; 7) 2%-ный раствор сахарозы; 8) реактив Фелинга; 9) пипетки; 10) фильтровальная бумага.