Работа № 1. Санитарно-бактериологическая оценка объектов окружающей

КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ ТГМА

Занятие № 12

 

САНИТАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Цель занятия:

Изучить методы и показатели, необходимые для санитарно-микробиологической оценки объектов окружающей среды.

 

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:

1. Природные микробиоценозы. Экологические связи в микробиоценозах.

2. Экологические ниши микробов:

· микрофлора почвы;

· микрофлора воды;

· микрофлора воздуха;

· микробиоценоз пищевых продуктов;

· микрофлора бытовых и производственных объектов и ее роль в распространении инфекционных болезней.

 

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:

• проводить оценку санитарно–бактериологического состояния воздуха, воды

и смывов с рук, предметов;

• определять бактерии группы кишечной палочки (БГКП).

 

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ИМЕТЬ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ

об оценке санитарно-бактериологического состояния почвы

 

Методические указания

Работа № 1. Санитарно-бактериологическая оценка объектов окружающей

Среды: воздуха, воды, почвы

 

а) Микрофлора воздуха

Цель: провести оценку санитарно-бактериологического состояния воздуха по общему микробному числу (ОМЧ) на МПА и количеству гемолитических стрептококков на кровяном агаре.

Сделать расчет ОМЧ по формуле Омелянского. Оценить чистоту воздуха по справочной таблице (см. теоретическую справку).

 

 

Опыт № 1. Посев воздуха методом седиментации по Коху на МПА.

Подсчитать количество выросших колоний.

 

Результат:

 

Опыт № 2. Посев воздуха методом седиментации по Коху на кровяной агар

Подсчитать количество выросших колоний.

 

 

 

Результат:

 

 

Заполнить таблицу.

 

Опыт	Метод	Результат	Оценка (чистый, грязный)
№ 1   № 2	Посев по Коху   Посев по Коху	ОМЧ =   количество гемолитических стрептококков =

 

Вывод:

 

б) Микрофлора воды

Цель: провести оценку санитарно-бактериологического состояния питьевой воды по результатам посевов. Определить ОМЧ, коли-титр, коли-индекс.

Оценить чистоту воды по справочной таблице (см. теоретическую справку). Сделать вывод.

 

Опыт № 3. Посев воды глубинным методом на МПА.

Подсчитать количество выросших колоний.

 

 

 

Результат:

 

Опыт № 4. Посев воды методом мембранных фильтров на среду Эндо.

Подсчитать количество выросших колоний на мембранном фильтре.

 

 

Результат:

 

Заполнить таблицу:

 

Опыт	метод	Результат	оценка (норма, выше нормы, ниже нормы)
№ 3   № 4	глубинный посев   мембранных фильтров	ОМЧ =   коли-титр = коли-индекс=

Вывод:

в) Микрофлора почвы

Цель: провести оценку санитарно-бактериологического состояния почвы по результатам посевов (см. теоретическую справку). Определить ОМЧ, коли-титр, коли- индекс, перфрингенс-титр.

Результаты внести в таблицу. Сделать выводы.

 

Опыт № 5. Посев почвы на МПА глубинным методом.

Опыт № 6. Посев почвы на среду Кесслера (для выявления БГКП).

Опыт № 7. Посев почвы на среду Эндо (для выявления БГКП).

Опыт № 8. Посев почвы на среду Вильсон-Блера (для выявления анаэробов).

Опыт № 9. Мазок, сделанный со среды Вильсон-Блера

 

Опыт	метод	Схема опыта	Результат	Оценка (норма, выше нормы, ниже нормы)
№ 5   № 6,7     № 8,9	Глубинный посев	посев -1 -3 -6 разведения почвы МПА в воде   посев   -1 -3 –6 Эндо (Гр-пал.) среда Кесслера       -1 -3 -6 среда (Гр+ споровые палочки) Вильсон-Блера	ОМЧ=     коли-титр=   титр-перфрингенс=

 

 

Вывод:

Кожи рук

 

Цель: сделать посев микрофлоры кожи рук методом отпечатков на МПА

и среду Эндо. Записать в тетрадь номер своего посева Посевы изучить на следующем занятии.

Дано: чашки со средами МПА, Эндо.

Теоретическая справка

Микрофлора воздуха

Санитарно-микробиологическое состояние воздуха закрытых помещений оценивают по микробному числу - количеству особей, обнаруживаемых в 1 м³ воздуха, наличию санитарно-показательных бактерий - представителей микрофло­ры дыхательных путей - гемолитический стрептококк, золотистый стафилококк.

Санитарно-микробиологическая оценка пищевых продуктов включает опре­деление микробного числа и санитарно-показательных микроорганизмов (БГКП), а также патогенных возбудителей.

Нормативы: чистый воздух зимой: ОМЧ не более 4500, гемолитических стрептококков - до 35;

грязный воздух зимой: ОМЧ более 7000, гемолитических стрептококков – до 124.

Нормативные показатели микробной обсемененности воздуха в помеще­ниях больницы

Операционные	ОМЧ	Золотистый стафилококк (в 250 л)
до начала работы	не более 500	не допускается
во время работы	не более 1000	не допускается
родильные комнаты	не более 1000	не допускается
палаты для недоношенных детей	не более 750	не допускается

Седиментационный метод (по Коху) - оседание микробов под действием силы тяжести - является простым способом изучения микрофлоры воздуха. Он заключается в том, что чашки Петри со средой оставляют открытыми на определенное время (5-10 минут на общую обсемененность и не менее 40 минут на кокковую микрофлору), затем их закрывают, надписывают и выдерживают в термостате 24 часа и 24 часа при комнатной температуре. Количество выросших колоний соответствует степени загрязненности воздуха: по приблизительному подсчету на площадь 100 см² в течение 5 минут оседает столько микробов, сколько их содержится в 10 л воздуха.

 

Аспирационный метод (метод Кротова) - более точный количественный метод оп­ределения микробного числа воздуха. Посев воздуха осуществляется с помощью прибора.

Аппарат Кротова устроен таким образом, что воздух с заданной скоростью просасывается через узкую щель плексиглазовой пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром. При этом частицы аэрозоля с содержащимися на них микроорганизмами равномерно фиксируются на всей поверхности среды благода­ря постоянному вращению чашки под входной щелью.

 

После инкубации посева в термостате проводят расчет микробного числа по формуле:

 

 

х= ^{а х 1000}

^V

х – количество микробов в м³ воздуха;

а - количество выросших на чашке колоний;

V - объем пропущенного через прибор воздуха, дм³ ;

1000 - объем воздуха, дм³.

 

Оценка санитарно-бактериологического состояния воздуха по общему микробному числу на МПА методом Коха проводится по формуле Омелянского:

 

 

х= ^{а х 100 х 5 х 1000}

^{В х 10 х Т}

х – количество микробов в м³ воздуха;

а – количество колоний в чашке;

Т – время экспозиции, мин;

В – площадь чашки Петри в см² (78.5 см²);

100 – площадь (см²), на которую происходило оседание микробов;

1000 – объем воздуха в литрах;

5 – время по расчету Омелянского, мин;

10 – объем воздуха (л), из которого происходило оседание микробов.

 

 

Микрофлора воды

Санитарно-микробиологическое состояние воды оценивается по: 1) микроб­ному числу - количеству мезофильных хемоорганотрофных бактерий в 1 мл воды; 2) коли-титру - наименьшему объему воды (мл), в котором обнаруживается БГКП и 3) коли-индексу - количеству БГКП в 1 л воды. Кроме того, в воде определяют наличие энтерококков, сальмонелл, энтеровирусов. Согласно ГОСТу на питьевую водопроводную воду, ее коли-титр должен быть не менее 300 мл, коли-индекс - не более 3, общее микробное число - не более 100.

Нормативы: ОМЧ не более 100, коли-титр - 333 мл, коли-индекс не более 3.

 

Метод мембранных фильтров

Мембранный фильтр помещают в воронку Зейтца, вмонтированную в колбу Бунзена, которая присоединяется к вакуумному насосу. Воду фильтруют в объеме 500 мл. Затем фильтры Зейтца помещают на поверхность среды Эндо в чашки Петри и после инкубации при 37°С в течение суток подсчитывают количество выросших колоний, типичных для БГКП.

Из 2-3 колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, позволяющий дифференцировать бактерии родов Escherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonadасеае и других оксидазоположительных бактерий, обитающих в воде.

Для этого фильтр с выросшими на нем колониями бактерий переносят пинцетом, не

перево­рачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченной диметил-фенилендиамином. При наличии оксидазы индикатор окрашивает колонию в синий цвет. 2-3 колонии, не изменившие первоначальную окраску, засевают в полужидкую среду с 0,5% раствором глюкозы. Посевы инкубируют в течение суток при 37°С. При наличии газообразования подсчитывают число красных колоний на фильтре и определяют коли-индекс.

Микрофлора почвы

Санитарно-микробиологическое состояние почвы оценивается на основании сопоставления количества термофильных бактерий и бактерий - показателей фекального загрязнения. Почвы, с преобладанием санитарно-показательных бакте­рий, расцениваются как санитарно-неблагополучные, загрязненными фекалиями человека или животных. Присутствие в почве Е. coli и Streptococcus faecalis указы­вает на свежее, бактерий родов Citrobacter и Enterobacter - на несвежее, a Clostridium perfringens - на давнее фекальное загрязнение. Более точная оценка проводится с помощью определения коли-индекса - количество бактерий группы кишечной палочки (БГКП), обнаруженных в 1г почвы, перфрингенс-титра - масса почвы (в граммах), в которой обнаружена 1 особь Clostridium perfringens, общей численно­сти сапрофитных, термофильных и нитрифицирующих бактерий в 1г почвы.

Нормативы: чистая почва: коли-титр - 1 и выше; перфрингенс-титр - 0,01 и выше; ОМЧ- 100-1000.

Загрязненная почва: коли-титр - 0,9 - 0,01; перфрингенс-титр - 0,009-0,0001; ОМЧ-1000-100000.

Сильно загрязненная почва: коли-титр - 0,009 и ниже; перфрингенс-титр -0,00009 и ниже; ОМЧ - 10000-4000000.

Ход исследования. ОМЧ. Почву берут на глубине 10-15 см стерильным но­жом (из разных мест не менее 10 проб) в стерильную банку. Из проб готовят навеску 30 г, которую вносят в колбу с водой (270 мл) и тщательно встряхивают. Готовят разведения 10^-3, 10^-4, 10^-5. Из 2-х последних разведений 0,1 мл смешивают с 40 мл 0,7% расплавленного и остуженного до 45°С МПА, после чего выливают двойным слоем в чашки с 2% агаром. Инкубируют в термостате. Подсчитывают количество выросших колоний.

Определение коли-титра, перфрингенс-титра.

Различные разведения почвен­ной суспензии засевают по 1 мл в пробирки со средой Кесслера ( 1л дистиллиро­ванной воды, 10 г пептона, 50 мл бычьей желчи, 10 г лактозы; рН 7,4-7,6; 4 мл 1% водного раствора генцианового фиолетового). Разливают в пробирки с поплавка­ми. Инкубируют при 43°С 48 часов. При получении в средах газообразования и помутнения производят высев петлей на среду Эндо. Отбирают типичные для кишечной палочки колонии, делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. При выявлении в мазках Гр- палочек ставят пробу на оксидазу. Если проба отрицательная (изменение окраски на синий цвет) проверяют ферментативные свойства выделенной культуры посевом на полужидкую среду с глюкозой. Появле­ние в среде кислоты и газа подтверждает наличие Е. coli. Определяют коли-титр по наименьшему объему, в котором обнаруживают БГКП.

Для определения перфрингенс-титра различные разведения почвенной сус­пензии засевают в пробирки со стерильной железосульфитной средой Вильсон-Блера. Инкубация при 43°С 48 часов. Учитывают результаты по образованию черных колоний Cl. perfringens в агаровом столбике среды. Мазки окрашивают по Граму, микроскопируют (Гр+ крупные палочки со спорами овальной формы, центрального или субтерминального расположения), вычисляют перфрингенс-титр (наибольшее разведение посевного материала, посев которого приводит к почерне­нию и разрыву среды впервые 12 часов роста при 43⁰ С).

КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ ТГМА

Занятие № 12

 

САНИТАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Цель занятия:

Изучить методы и показатели, необходимые для санитарно-микробиологической оценки объектов окружающей среды.

 

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:

1. Природные микробиоценозы. Экологические связи в микробиоценозах.

2. Экологические ниши микробов:

· микрофлора почвы;

· микрофлора воды;

· микрофлора воздуха;

· микробиоценоз пищевых продуктов;

· микрофлора бытовых и производственных объектов и ее роль в распространении инфекционных болезней.

 

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:

• проводить оценку санитарно–бактериологического состояния воздуха, воды

и смывов с рук, предметов;

• определять бактерии группы кишечной палочки (БГКП).

 

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ИМЕТЬ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ

об оценке санитарно-бактериологического состояния почвы

 

Методические указания

Работа № 1. Санитарно-бактериологическая оценка объектов окружающей

Среды: воздуха, воды, почвы

 

а) Микрофлора воздуха

Цель: провести оценку санитарно-бактериологического состояния воздуха по общему микробному числу (ОМЧ) на МПА и количеству гемолитических стрептококков на кровяном агаре.

Сделать расчет ОМЧ по формуле Омелянского. Оценить чистоту воздуха по справочной таблице (см. теоретическую справку).

 

 

Опыт № 1. Посев воздуха методом седиментации по Коху на МПА.

Подсчитать количество выросших колоний.

 

Результат:

 

Опыт № 2. Посев воздуха методом седиментации по Коху на кровяной агар

Подсчитать количество выросших колоний.

 

 

 

Результат:

 

 

Заполнить таблицу.

 

Опыт	Метод	Результат	Оценка (чистый, грязный)
№ 1   № 2	Посев по Коху   Посев по Коху	ОМЧ =   количество гемолитических стрептококков =

 

Вывод:

 

б) Микрофлора воды

Цель: провести оценку санитарно-бактериологического состояния питьевой воды по результатам посевов. Определить ОМЧ, коли-титр, коли-индекс.

Оценить чистоту воды по справочной таблице (см. теоретическую справку). Сделать вывод.

 

Опыт № 3. Посев воды глубинным методом на МПА.

Подсчитать количество выросших колоний.

 

 

 

Результат:

 

Опыт № 4. Посев воды методом мембранных фильтров на среду Эндо.

Подсчитать количество выросших колоний на мембранном фильтре.

 

 

Результат:

 

Заполнить таблицу:

 

Опыт	метод	Результат	оценка (норма, выше нормы, ниже нормы)
№ 3   № 4	глубинный посев   мембранных фильтров	ОМЧ =   коли-титр = коли-индекс=

Вывод:

в) Микрофлора почвы

Цель: провести оценку санитарно-бактериологического состояния почвы по результатам посевов (см. теоретическую справку). Определить ОМЧ, коли-титр, коли- индекс, перфрингенс-титр.

Результаты внести в таблицу. Сделать выводы.

 

Опыт № 5. Посев почвы на МПА глубинным методом.

Опыт № 6. Посев почвы на среду Кесслера (для выявления БГКП).

Опыт № 7. Посев почвы на среду Эндо (для выявления БГКП).

Опыт № 8. Посев почвы на среду Вильсон-Блера (для выявления анаэробов).

Опыт № 9. Мазок, сделанный со среды Вильсон-Блера

 

Опыт	метод	Схема опыта	Результат	Оценка (норма, выше нормы, ниже нормы)
№ 5   № 6,7     № 8,9	Глубинный посев	посев -1 -3 -6 разведения почвы МПА в воде   посев   -1 -3 –6 Эндо (Гр-пал.) среда Кесслера       -1 -3 -6 среда (Гр+ споровые палочки) Вильсон-Блера	ОМЧ=     коли-титр=   титр-перфрингенс=

 

 

Вывод: