Использование промышленных бактериальных препаратов

На основании способности микроорганизмов утилизировать углеводороды нефти, создано большое количество биопрепаратов, которые применяют для восстановления почв, подверженных нефтяному загрязнению.

Биопрепараты разрабатываются на основе нефтеокисляющей микрофлоры, которая в отличие от микроорганизмов нефтезагрязненных почв более устойчива к высоким дозам нефтяных загрязнений. Основная их роль при производстве рекультивационных работ состоит в том, чтобы активизировать разложение токсичных для почвенной биоты соединений нефти и продуктов ее трансформации, осуществить за короткое время разложение миграционно-активных фракций, подготовить субстрат для дальнейшего самоочищения естественной микрофлорой. Обработка почв растворами препаратов, выпускаемых в жидкой или сухой форме, позволяет в значительной степени снизить ингибирующее действие углеводородов нефти на почвенную микрофлору.

В настоящее время на основе моно- и смешанных культур разработано и активно используется большое число биопрепаратов, предназначенных для очистки природных и техногенных сред.

Использование в качестве деструкторов углеводородов микробных консорциумов (смесь нескольких штаммов микроорганизмов) со сложными ассоциативными связями наиболее перспективно для очистки почвы и воды в короткие сроки. Потенциал консорциума микроорганизмов не является результатом простого суммирования свойств отдельных штаммов, входящих в ассоциацию, и, как правило, существенно превышает потенциал препарата, состоящего из монокультуры. Но при этом необходимо понимать, что стоимость такого микробного препарата (консорциума) будет всегда выше, чем препарата из монокультуры, если только он не является высушенным активным илом со станций биологической очистки сточных вод, компостом, пометом или навозом, полученным при высушивании и измельчении.

В настоящее время производится три основные формы биопрепаратов нефтеокисляющего действия – жидкая (несепарированная биомасса после ферментации с массовой долей влаги 99% и титром 10⁷-10⁸ живых клеток/см³), пастообразная (сепарированная биомасса с массовой долей влаги 30% и титром 10⁹-10¹⁰ живых клеток/см³) и сухая (лиофилизированная или распылительно высушенная в токе теплого воздуха биомасса с влажность 3-5% и титром 10⁹-10¹¹ живых клеток/г препарата).

Основные преимущества, которые дает использование биопрепаратов состоят в следующем. Во-первых, внесение нефтеокисляющих микроорганизмов в нефтезагрязненые субстраты способствует оптимизации биологической активности практически стерильных почв (если речь идет об участках свежих нефтеразливов с большой глубиной пропитки почвенного субстрата), что не только ускоряет биоразложение нефти, но и сохраняет эту активность во времени. Во-вторых, препараты снимают острое токсическое действие нефти на почвенную микробиоту в короткие сроки и способствуют очищению грунтов от продуктов промежуточного распада нефтеуглеводородов, в том числе и от водорастворимых соединений. В-третьих, не всю нефть можно собрать техническими средствами, особенно, если речь идет о почвах с высокой адсорбирующей способностью. Проведение только агротехнических мероприятий (фрезеровка, внесение минеральных удобрений) эффективно лишь на участках старых нефтеразливов или на объектах с невысоким уровнем нефтяного загрязнения, то есть там, где степень естественной биологической активности почв достаточно высока. На участках с высоким уровнем нефтяного загрязнения только агротехнические мероприятия дают эффект снижения уровня загрязнения на 15-20 % в течение 1 сезона, только препараты - до 40 %, а комплексная биорекультивация - агротехнические мероприятия + биопрепараты способствуют очистке почв до 60-80 % в течение 1 сезона работ.

В период с 2001 по 2003 г. в Республике Коми был проведен беспрецедентный опыт по испытанию серии биопрепаратов, разработчиками которых являлись отечественные и зарубежные ученые. 

В испытаниях принимали участие МГУ (Москва) с биопрепаратом «Родер», НТО «Приборсервис» (Томск) с комплексной технологией, включающей использование биопрепарата «Петролан» на торфоносителе, минеральных удобрений и микроэлементов, Институт биологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар) с биопрепаратом на ПАВ-носителе «Универсал»,000 «Республиканский центр по рекультивации нарушенных земель» (Сыктывкар) с технологией Института биологии - применение «Лигносорбента» С инокулированным на его поверхности биопрепаратом «Универсал» и БАГов (биологическиактивных гранул) в качестве посевного материала, ФГУП НИПИ «Комимелиоводхозпроект» (Сыктывкар) с методом агробиологического стимулирования процессов очищения почв, НТЦ «НИКА» (С.-Петербург) с биопрепаратами «Бамил» и «Омуг», чешская фирма «Деконта» С собственным биопрепаратом. В 2003 году в эксперименте начала участвовать французская компания «Total Fiпа ELF» с собственной технологической разработкой.

По результатам опытов, проведенных с целью оценки эффективности различных технологических приемов биовосстановления нефтезагрязненных земель в условиях Крайнего Севера в период с 2001 по 2004 г. было экспериментально установлено следующее.

1. Все испытанные в опытах биопрепараты положительно влияют на усиление биологической активности почвы.

2. Наибольший эффект активизации нефтеокисляющей активности почв наблюдается при многократном (двух-трехкратном) применении препаратов.

3. Применение препаратов наиболее эффективно одновременно с агротехническими приемами, что отражено не только в полученных экспериментальных результатах, но и в технологических рекомендациях разработчиков испытанных биопрепаратов.

4. Среди испытанных препаратов наиболее эффективными оказались препараты Родер (МГУ), Петралан (НТО «Приборсервис»), Универсал (Институт биологии Коми НЦ УрО РАН), Омуг (НТЦ НИКА).

5. Методы агрохимического стимулирования очищения почвы и восстановления растительности эффективны для активизации естественного микробоценоза, но проявляется это только на второй-третий год после проведения агрохимических обработок.

6. Факторы окружающей среды, такие как температура и влажность по-разному влияют на процессы очищения почвы от нефти и рост трав. Для очищения почв от нефти наиболее важен фактор увлажнения, как при использовании биопрепаратов, так и при рекультивации только с применением минеральных удобрений. Переувлажнение отрицательно влияло на рост высеваемых злаков. Температурный фактор не значим для роста трав, практически не влияет на активность биопрепаратов, но может быть существенным при самоочищении почв и при стимулировании нефтеокисления только агрохимическими способами.

На территории деятельности филиала «Муравленковскнефть» ОАО «Газпромнефть-ННГ» в 2010-2011 г. проводились испытания эффективности шести препаратов-нефтедеструкторов: Центрин, МД, Родер, Универсал, Биоойл, Деворойл.

Биопрепарат Деворойл. Это один из первых отечественных препаратов, который с 90-х годов прошлого века широко и успешно применяется для биоремедиации почв, грунтов и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Биопрепарат, созданный силами Института микробиологии Российской Академии Наук (ИНМИ РАН) и ООО «Биотехинвест», представляет собой композицию из бактериальных и дрожжевых нефтеокисляющих микроорганизмов, выделенных из пластовых вод месторождений Татарии [85]. В препарат входят пять видов микроорганизмов (Candida sp. BKM Y-2778, Pseudomonas stutzeri BKM B-1972, Rhodococcus erythropolis BKM Ac-1502, Rhodococcus maris BKM Ac-1501, Rhodococcus sp. BKM Ac-1500). В одном грамме препарата содержится не менее 2,8*10⁸ клеток.

Микроорганизмы сообщества способны эффективно окислять широкий спектр углеводородов нефти, в том числе и ароматические углеводороды, в широком диапазоне кислотности среды (рН 5.5–9.5), температур (5–40°С) и солености среды (до 150 г/л). Специальные добавки, введенные в состав препарата, значительно активизируют процесс деструкции нефти.

Препарат способен к комплексному разложению как растворимых, так и нерастворимых в воде компонентов нефти (при внедрении в толщу нефтяной пленки).

С помощью биопрепарата Деворойл возможна утилизация различных типов сырой нефти: высоко- и низкопарафинистой нефти, нефти с высоким содержанием серы и т.д.; а также различных типов нефтепродуктов: мазута, дизельного топлива, бензина и керосина; ароматических веществ (фенол, крезол и т.д.).

Биопрепарат Универсал. Этобиопрепарат-нефтедеструктор, разработанный в Республике Коми в Институте Биологии Коми НЦ Уро РАН Маркаровой М.Ю. на основе нефтеокисляющих бактерий, выделенных из загрязненных нефтью почв Усинского и Ухтинского районов Республики Коми и ряда месторождений Тюменской области. В состав препарата входят бактерии и дрожжи следующих видов: Variovarax paradoxus, Rhodotorulla glutinis (2-4M), Rhodococcus egui (Y5-25, 34-1) Pseudomonas fluorescens (2-2 T, K-2), Kurthia sibirica (15-2-1).  Токсикологическая экспертиза проведена по 12 видам нефтеокисляющих микроорганизмов, которые и применяются в составе комплексного препарата Универсал. В зависимости от состава нефти подбирается оптимальная композиция штаммов. На каждый из штаммов составлены паспорта безопасности. На препарат имеется Санитарно-эпидемиологическое заключение № 77.01.12.929.П.01654.01.3 от 29.01.03, разрешающее его применение в природе.

Биопрепарат Универсал применяется для разложения нефтей, отличающихся вязкостью, плотностью, составом, и может быть рекомендован для производства работ по биоремедиации почв и вод в суровых условиях Крайнего Севера России.

Биопрепарат МД. Компания ООО «ЭКОЙЛ» (Томск) разработала, выпускает и применяет комплексные биопрепараты с маркой МД для ликвидации технологических и аварийных разливов нефти на магистральных и  на внутрипромысловых нефтепроводах, на территории предприятий, для обезвреживания нефтешламов перерабатывающих предприятий,  нефтешламовых амбаров, для отчистки  нефтезагрязненного грунта.

Комплексные биопрепараты «МД» основаны на способности микроорганизмов-деструкторов использовать в качестве источников питания нефть и нефтепродукты. В процессе жизнедеятельности микроорганизмы перерабатывают их до простейших химических веществ.

Температурный диапазон работы препаратов – от +5 до +37^оС, диапазон рН от 5,0 до 8,5.

Биопрепарат Биоойл. Это серия микробных препаратов создана ЗАО «Биоойл» (Новосибирск) при участии сотрудников ФГУН ГНЦ Вирусологии и Биотехнологии «Вектор», с использованием производственной базы Новосибирского государственного университета. Штаммы, послужившие основой ассоциаций – микроорганизмы - деструкторы нефти взяты из образцов воды и почвы на месторождениях ОАО «Сибнефть-Ноябрьскнефтегаз» в Пуровском районе ЯНАО.

Ассоциация представляет собой смесь культур микроорганизмов: Acinetobacter sp. 24, Enterobacter sp. 16a, Bacillus sp. 5a, Bacillus sp. 5b, Saccharomyces sp. DH-1, активно катаболизирующих длинноцепочечные предельные углеводороды.Культуры находятся в лиофилизированном состоянии, при поставке расфасовываются в емкости, т.е. поставка препаратов осуществляется в виде упакованного в тару порошка, как правило, в пластиковые баночки емкостью 10 мл (норма для обработки 1га загрязненных земель).

Штаммы ассоциации депонированы в НИИ «Коллекция культур микроорганизмов» Государственного научного центра вирусологии и биотехнологий «Вектор», Новосибирская обл., Кольцово.

Имеется заключение НИИ «ККМ» на то, что штаммы не являются зоопатогенными, фитопатогенными, не представляют опасность по другим причинам.

Препараты «Биоойл-СН», «Биоойл-Югра» эффективны в диапазоне температур от +4ºС до +31ºС и кислотности почвы от pH=4.0

Достоинством препаратов Биоойл является высокая концентрация микробных тел в 1 грамме препарата. Применение авторского ноу-хау позволило сделать препараты марки Биоойл в тысячу раз более концентрироваными, чем все другие препараты для рекультивации почвы и водоемов, загрязненных нефтью. Так, если других препаратов-нефтедеструкторов для обработки 1га нефтезагрязненных земель требуется от 1,5кг до 100кг, препаратов Биоойл – только  5 -10г. По этому показателю им нет равных в мире.

Биопрепарат Родер. Препарат Родер разработан в 1992 для очистки загрязненных углеводородами нефти и нефтепродуктов поверхностей пресных и минерализованных вод, почв, болот, почво-грунтов, нефтешламов с НПЗ.

Препаратсостоит из двух штаммов бактерий, относящихся к роду Rhodococcus, (R.ruber Ac-1513 D and R. erythropolis Ac-1514 D), выделенных из почв, загрязненных нефтью. Как показали исследования на патогенность, токсичность и токсигенность, штаммы не патогенны для людей, животных и растений и не вызывают мутаций у бактерий. Штаммы депонированы во Всероссийскую Коллекцию Микроорганизмов (ВКМ) и запатентованы. Уточнено их филогенетическое положение и определены последовательности в 16s РНК у обоих штаммов, что позволяет контролировать несанкционированное использование препарата.

Бактерии-деструкторы препарата Родер благодаря своей липофильной клеточной стенке сразу же, как только их наносят на очищаемую поверхность, прикрепляются к пленке нефти на разделе фаз нефть-вода или нефть-почва и включаются в процесс биодеградации углеводородов. Благодаря способности клеток препарата «Родер» жить на разделе фаз вода-нефть для их применения на водной поверхности не требуется иммобилизация клеток на носителе (сорбенты), что существенно удешевляет процесс биоремедиации загрязненного углеводородами объекта.

Штаммы проявляют синергизм при совместной деградации углеводородов нефти, поскольку различаются по субстратной специфичности (алифатические или ароматические углеводороды) и скорости роста.

Антагонистических взаимоотношений с аборигенной микрофлорой не наблюдается. Препарат Родер и продукты биодеструкции углеводородов нефти не оказывают вредного действия на окружающую среду.

Температурный диапазон действия препарата в почве или воде 8-32^оС. Диапазон рН, в котором препарат активно работает  5,8-7,8. Препарат Родер действует в широком диапазоне концентраций углеводородных загрязнений от 25% и выше, но наиболее эффективен при более низком уровне загрязнения, который остается после применения механических или химических методов сбора основной массы загрязнителя.

Биопрепарат Центрин. Препарат, разработанный военными специалистами в Екатеринбурге, применяется для биоремедиации загрязненных нефтью почв. Выпускается в виде жидкого концентрата и поставляется в канистрах емкостью 25 л. Перед применением препарата требуется его активизировать в течение 24 часов. Для этого в водный раствор с биопрепаратом (200 л) необходимо добавить сахар (1 кг) и нефть (1 л) и аэрировать в течение суток.

Эффективность действия препаратов оценивали по нескольким показателям (суммарное количество деградировавшей нефти по данным ИК-спектроскопии и гравиметрического анализа, эффективность деградации ПАУ, снижение интенсивности пиков индивидуальных углеводородов на хроматограммах из гексановых экстрактов, дегидрогеназная активность, интенсивность потребления минеральных соединений азота и фосфора).

В полевом эксперименте проверяли в сравнении эффективность препаратов-нефтедеструкторов нефти с целью выбора наиболее эффективного для дальнейшего применения в условиях ЯНАО. На основании полученных данных было показано, что снижение общего содержания нефтепродуктов за время проведения полевого эксперимента на делянках, дважды обработанных препаратом «Универсал» составило 79% в слое 0-10 см и 95% в слое 10-30 см, у остальных препаратов эти показатели заметно ниже.

Лабораторный эксперимент по сравнению эффективности препаратов-нефтедеструкторов нефти с нефтезагрязненной минеральной почвой показал, что в пробах почв после завершения процесса биоремедиации происходит деградация УВ алифатического ряда. Наиболее эффективным деструктором алифтических УВ нефтяного загрязнения минеральной почвы является препарат Родер.

Методом Высокоэффективной Жижкостной Хроматографии (ВЭЖХ) была исследована способность препаратов-нефтедеструкторов утилизировать ПАУ, которые присутствуют в загрязненной нефтью минеральной почве. Основываясь на полученных результатах, можно сделать вывод о том, что самый активный деструктор ПАУ из проверяемых препаратов для биоремедиации минеральной почвы, загрязненной нефтью – Биоойл. Хорошие результаты показал препарат Центрин.

Скорость деструкции нефти зависит от микробиологической активности почвы. В лабораторном эксперименте сравнивался такой показатель микробиологической активности, как дегидрогеназная активность почвы до, в процессе и после применения исследуемых препаратов-нефтедеструкторов. Полученные результаты показывают, что самой высокой дегидрогеназной активностью, а соответственно и потенциалом к самоочищению, обладает почва, трижды обработанная препаратом Родер, с предварительной обработкой гуматом.

По результатам проведенных исследований препараты по совокупности показателей были ранжированы в порядке убывания эффективности следующим образом: Универсал, Родер, МД, Биоойл, Центрин, Деворойл.

В 2011 г был проведен еще один полевой эксперимент на территории деятельности «Муравленковскнефть». В этом эксперименте проверяли способность биопрепарата (на примере биопрепарата «Родер») очищать от свежего разлива нефти торфянистую почву верхового болота без проведения классических Подготовительного и Агрономического этапов биорекультивации. Делалось это также с целью изучения возможности обходиться без этих двух предварительных этапов биорекультивации для удешевления стоимости работ. Полевой эксперимент по обработке биопрепаратом показал, что в течение одного сезона после трехкратной обработки можно достичь существенного снижения концентрации нефтепродуктов (на 32-98%), однако достигнуть показателей качества, позволяющих осуществить сдачу-приемку рекультивированного участка при этом не удается. Это еще раз свидетельствует о необходимости достижения параметров качества, предусмотренных техническим этапом рекультивации.

 

Материалы: потребность и использование

Рекомендуемые биопрепараты и условия их применения для биологической рекультивации почв приведены в Таблица 28. Сопроводительные документы к рекомендованным биопрепаратам, подтверждающие их качество (санитарно-эпидемиологические заключения, гигиеническая характеристика продукции, сертификат соответствия, инструкция по применению), приведены в Приложении №11.

Допускается применение других биопрепаратов при условии, что они имеют все разрешительные документы на их применение, установленные законодательством РФ, прошли процедуру допуска в соответствии с требованиями Заказчика и протестированы в лабораторных и полевых условиях с учетом климатических и природных особенностей лицензионных участков на территории ЯНАО.

Способ применения каждого биопрепарата регламентирован в инструкции его применения, предлагаемой его производитем. Для большинства биопрепаратов предполагается дробное внесение на участок определенных доз препарата. Поэтому при составлении Планов производства работ следует учитывать дробность внесения (число обработок одной дозой) разных биопрепаратов и необходимость проведения механической обработки почвы. Применение ряда препаратов (например, Деворойл) требует внесение дополнительной подкормки минеральными удобрениями методом дождевания через 14 дней после внесения биопрепарата, что также регламентировано инструкцией производителя. Этот аспект также должен быть отражен в Плане производства работ.

Доза внесения биопрепарата рассчитывается как отношение рекомендованного производителем биопрепарата количества (в зависимости от степени загрязнения участка) к числу обработок одной дозой. Следует четко соблюдать время между внесением доз (данные предоставляет производитель биопрепарата).

Биопрепараты могут быть использованы только в случае, если:

- на этапе удаления (срезки, сбора, отмывки) загрязнения достигнуто остаточное содержание нефтепродуктвов в почве, разрешающее проведение микробиологической обработки (нормативные значения контрольных показателей на стадии «завершение технического этапа», 39);

- состояние рекультивируемого участка и окружающей среды отвечает условиям применения биопрепарата, указанным производителем (Таблица 28);

- соблюдаются сроки внесения биопрепаратов с учетом дробности их внесения и необходимости проведения механической обработки почвы (внесение биопрепаратов позднее второй декады августа недопустим).

Эффективность использования биопрепаратов зависит от ряда факторов: исходное содержание нефтепродуктов в грунте, сроки начала работ, марка используемого биопрепарата, дробность внесения используемого биопрепарата, временной интервал между внесением доз, расход биопрепарата, ориентировочная длительность биологического этапа рекультивации используемым биопрепаратом, обеспеченность почвы кислородом (достигаемая посредством механической обработки почвы и/или полива почвы аэрированной водой).

Исходное содержание нефтепродуктов в грунте определяет расход биопрепаратов и ориентировочные сроки окончания биологического этапа рекультивации. Нормы внесения и расход биопрепаратов определяется в зависимости от исходного содержания нефтепродуктов в почве в соответствии с информацией [8], представленной производителями соответствующих биопрепаратов.

Объем биопрепарата, соответствующий норме его внесения в почву, может быть, по рекомендации производителя, внесен в почву дозами, т.е. дробно (см. табл. 29).

Таблица 28

Сравнительная характеристика некоторых биопрепаратов [9]

(приведена в порядке примеров)

№

П/п