Перечислите в порядке очередности основные этапы приготовления гистологических препаратов для микроскопии, объясните их суть.

1. Взятие материала.

Берут кусочки органов и тканей величиной не более 1 см³. Материал желательно получать как можно раньше после смерти людей (метод исследования материала трупа человека — аутопсия). С диагностической целью материал может забираться у людей прижизненно с помощью специальных инструментов или во время операций. Этот способ получения материала носит название биопсии.

2.Фиксация.

Взятый материал сразу же должен подвергаться фиксации. Фиксация – метод обработки ткани с целью закрепления ее прижизненной структуры. Это достигается путем воздействия на ткань специальных растворов (фиксаторов). Наиболее существенным изменением, происходящим в тканях под воздействием фиксатора, является процесс свертывания (коагуляции) белков. Количество фиксатора следует брать в 20-100 раз больше объема кусочка фиксируемого материала. Продолжительность фиксации – от нескольких часов до 1 суток и более в зависимости от свойств фиксатора и характера исследуемого материала.

3.Помывка в воде.

После фиксации материал промывают (чаще всего в течение нескольких часов в проточной воде) с тем, чтобы избавить его от избытка фиксатора и различных осадков фиксирующих жидкостей.

4. Обезвоживание.

Обезвоживание ткани производятся постепенно (чтобы не произошло сморщивание) путем проведения ее через спирты возрастающей крепости: 50º, 60º, 70º, 80º, 90º, 96º, 100º. В каждом спирте кусочки находятся от нескольких часов до 1 суток в зависимости от величины кусочка.

5.Уплотнение (заливка).

При заливке кусочки предварительно пропитываются теми жидкостями, которые служат растворителями для парафина (ксилол или толуол). При заливке в парафин кусочки из абсолютного спирта переносятся в смесь абсолютного спирта с хлороформом или ксилолом, затем чистый ксилол и, наконец, в расплавленный насыщенный раствор парафина в хлороформе, где они находятся в термостате при температуре 37º до 1 суток и более. Дальнейшая заливка проводится в термостате при температуре 54º -56º в трех порциях парафина. Окончательная заливка проводится в парафин с добавлением воска, который наливают в специальные бумажные коробочки или стеклянные чашки, а затем эти коробочки или чашки после появления на поверхности парафина пленки, погружают в воду. Происходит полное затвердение парафина. Кусочки с окружающим их парафином извлекают из коробочек и с помощью расплавленного парафина, наклеивают на деревянные кубики, получаются парафиновые блоки.

Уплотнения также можно добиться замораживанием кусочка органа (срочная биопсия).

6. Приготовление срезов.

Срезы с блоков изготовляются на микротоме. Наиболее распространены микротомы - санный и замораживающий. В специальных устройствах микротома зажимается парафиновый блок и микротомный нож. Существует механизм, поднимающий объектодержатель с блоком на заданное количество микрометров. Это позволяет при каждом скольжении ножа в плоскости параллельной поверхности блока получать срезы толщиной 5-10 микрометров с парафиновых блоков.

7. Окрашивание.

Перед окраской из парафиновых срезов обязательно удаляют парафин (растворением в ксилоле). Окрашивание необходимо производить для того, чтобы отчетливо выявить под микроскопом тонкие структуры объекта. В неокрашенных срезах большинство структур одинаково преломляет свет, поэтому рассмотреть их не удается.

Выявление на срезе гистологических структур основано на неодинаковом их отношении к красителям. Чаще всего для окрашивания гистологических срезов применяется окрашивание раствором гематоксилина (приготовленным по методу Бемера) и 1-2% эозином.

8. Заключение среза.

Окрашенные и промытые в воде срезы во избежание помутнения обезвоживают в спиртах (70º, 96º), просветляют в карбол-ксилоле, ксилоле, а затем на предметное стекло, где находится срез, помещают каплю бальзама и срез накрывают покровным стеклом. Бальзам представляет собой растворенную в ксилоле смолу одного из видов сосны (канадский бальзам), смолу пихты (сибирский бальзам) или специальную синтетическую среду.

 

2. Какова цель фиксации, приведите примеры фиксирующих жидкостей. Какова цель заливки тканей и органов в парафин и др. твердые среды, приведите примеры заливочных сред.

· Цель фиксации – сохранить структуры клеток, тканей, органов в неизменном состоянии. В противном случае под действием собственных ферментов, действия гнилостных организмов и в силу других причин образец становится непригодным.

· Одним из лучших фиксаторов является забуференный изотонический раствор 4% формальдегида. Также используют глютаральдегид,  хромовую кислоту, жидкость Ценкера тетраоксид осмия, спирты (этанол, метанол); ацетон; соли ртути (сулема); кислоты (уксусная, трихлоруксусная, пикриновая, азотная).

· Цель заливки - предотвращение раздавливания и сминания ткани при разрезании, возможность получить тонкие срезы стандартной толщины.

· Заливочные среды: жидкий парафин, целлоидин (практически не используется), пластические смолы. 

 

Какова цель изготовления тонких срезов тканей и органов? С какой целью окрашивают срезы тканей и органов для световой микроскопии? Понятие о базофилии и ацидофилии. Окрашивание гематоксилин-эозином (суть метода, результат окрашивания).

· Цель - уменьшение толщины материала для того, чтобы он просвечивался в световом микроскопе.

· С какой целью окрашивают срезы - различие отдельных структур тканей и клеток, т.к. без окрашивания клеточные структуры бесцветны и прозрачны.

· БАЗОФИЛИЯ - способность кислых структур клетки окрашиваться основными красителями (гематоксилин, толуидиновый синий, метиленовый синий).

· АЦИДОФИЛИЯ- способность основных структур клетки окрашиваться кислыми красителями (эозин, оранж G, кислый фуксин).

· Суть:

1) Парафиновые срезы освобождают от парафина

2) Производят гидратацию срезов путём поэтапного помещения их в спирты убывающей концентрации, а затем в дистиллированную воду На 3-4 мин.

3) Окрашивают срезы сначала раствором ядерного (основного) красителя - гематоксилина – В течение 2 мин.

4) После этого срезы переносят в водопроводную воду, которая имеет щелочную среду, для окисления гематоксилина. При этом он приобретает синий цвет, а затем всполаскивают в дистиллированной воде.

5) Окрашивают срезы раствором цитоплазменного (кислого) красителя - Эозина – в течение 0,5-1 мин.

6) Избыток красителя смывают дистиллированной водой в течение 1 мин.

7) Окрашенные срезы обезвоживают. Для этого их помещают в Спирты возрастающей концентрации.

8) Обезвоженные срезы просветляют в карбол-ксилоле, а затем в двух порциях ксилола – по 2 мин.

9) Заключение срезов.

· Сочетает в себе основной и кислый красители, поэтому позволяет выявить почти все структуры. Ядра - сине-фиолет, Цитоплазма—желто-розов.

 

4. Назовите виды микроскопии, с помощью которых можно исследовать живые клетки и культуры тканей. Опишите суть данных методов и механизм возникновения изображений.

· Темнопольный микроскоп применяется для получения изображений прозрачных живых объектов. Используется эффект Тиндаля (который позволяет видеть пылинки в луче света в темной комнате). Под конденсором установлена заглушка таким образом, чтобы свет попадал только на края конденсорной линзы. Поэтому свет, выходящий из конденсора, не попадает в объектив: при отсутствии образца видно только темное поле. При наличии препарата свет, проходя через него, отклоняется и попадает в объектив: объект выглядит очень светлым на темном фоне (с очень большим контрастом).

· Фазово-контрастный микроскоп применяется для исследования изображений прозрачных (неокрашенных) объектов, особенно живых клеток в культуре. Препарат должен быть тонким. В основе метода лежит следующее явление: скорость света зависит от среды, через которую он проходит. При переходе из воздуха в более плотную среду электромагнитная волна замедляется. Поскольку разные участки препарата имеют разные показатели преломления, то лучи, прошедшие через оптически более плотные участки, будут отставать от лучей, прошедших через оптически менее плотные участки – возникает фазовый сдвиг между лучами. Величина сдвига зависит от показателей преломления сред и длины пути, пройденного в каждой среде. Однако фазовый сдвиг не улавливается глазом человека. Поэтому специальные устройства (заглушка; фазовая пластинка в объективе) преобразуют фазовый сдвиг в различия в интенсивности (яркости) света, которые воспринимаются глазом.

· Интерференционная микроскопия – это дальнейшее развитие фазово-контрастной и поляризационной микроскопии. Этот метод дает возможность наблюдать прозрачные и бесцветные объекты, но их изображения могут быть и разноцветными (интерференционные цвета). Суть метода состоит в том, что каждый луч, входящий в микроскоп, раздваивается. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, другой — мимо неё. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Результат интерференции определяется разностью хода лучей (луч, проходящий через объект, запаздывает по фазе). Величина этого запаздывания измеряется компенсатором. В методе дифференциального интерференционного контраста (ДИК) обе волны проходят через один и тот же объект с небольшим боковым смещением. Наибольшее распространение получил вариант ДИК по Номарскому, в котором разделение и сведение пучков производятся в поляризованном свете с помощью специальных двоякопреломляющих призм, установленных соответственно перед конденсором и после объектива. Величина разведения пучков выбирается близкой к разрешающей способности микроскопа, чтобы не было заметно двоение изображения. Получаемое цветное изображение рельефно.