Методы выделения и идентификация

 

Дубильные вещества - это смесь различных полифенолов, имеющих нередко сложную структуру, и очень лабильных, поэтому выделение и анализ индивидуальных компонентов представляет собой большие трудности.

При выделении из растительного материала получают фракции дубильных веществ. Для этого используют экстракцию растительного материала органическими растворителями; обрабатывают сырье петролейным эфиром, бензолом или смесью бензол - хлороформ (1:1) для удаления основной массы хлорофилла, терпеноидов и липидов, затем экстрагируют этиловым эфиром, который извлекает некоторые фенольные соединения, в том числе оксикоричные кислоты и катехины; после этого проводят экстракцию этилацетатом, в результате которой в экстракт переходят лейкоантоцианы, димерные проантоцианидины, эфиры оксикоричиых кислот и др. В завершение растительный материал экстрагируют метиловым или этиловым спиртом, при этом в раствор переходят многие дубильные вещества и другие фенольные соединения.

Для получения суммы дубильных веществ используются и другие способу: растительное сырье вначале экстрагируют горячей водой, а затем охлажденный водный экстракт обрабатывают последовательно вышеперечисленными растворителями.

Широко распространено выделение фенадьных соединений, в том числе и некоторых компонентов дубильных веществ, осаждением из водных или спирто-водных растворов солями свинца. Полученные осадки затем обрабатывают разбавленной серной кислотой.

Суммарные извлечения дубильных веществ разделяют на индивидуальные компоненты с помощью хроматографических методов.

Для выделения индивидуальных компонентов дубильных веществ (катехинов, лейкоантоцианиднов и др.) используют различные виды хроматографии:

1. адсорбционную хроматографию на колонках целлюлозы, полиамида (иногда вместо полиамида используют гольевой порошок);

2. ионообменную - на колонках катионита Дауэкс-50 В в Н⁺-форме;

.   распределительную хроматографию на колонках силикагеля;

.   протипоточное распределение,

.   гельфильтрацию на колонках Сефадекса Г-50, Г-100 и др.

Идентификация индивидуальных компонентов дубильных веществ основана на хроматографических методах (хроматография на бумаге и тонкослойная), спектральных исследованиях, качественных реакциях и изучении продуктов расщепления.

Хроматограммы дубильных веществ просматривают в УФ свете и отмечают характер флуоресценции зон адсорбции. Некоторые производные катехинов имеют слабую голубую флуоресценцию, усиливающуюся после обработки хроматограмм парами аммиака. Чаще всего для обнаружения катехинов и лейкоантоцианидинов и их производных на хроматограммах используют 1%-ный ванилин в концентрированной HCl. Лейкоантоцианидины можно отличить от катехинов при выдерживании хроматограммы в парах соляной кислоты с последующим нагреванием при 105 °С в течение 2 мин, при этом лейкоантоцианидины переходят в антоцианидины (розовый, красно-фиолетовый цвет), а катехины остаются бесцветными или желтеют.

Для более детальной идентификации веществ используют также методы УФ, ИК и ПМР спектроскопии.

Для изучения структуры дубильных веществ широко применяют гидролиз (в частности, ферментативный с помощью танназы), щелочное расщепление с последующим анализом полученных продуктов.

Качественное определение

 

Дубильные вещества в растительном сырье определяют качественными реакциями, которые можно подразделить на две группы: реакции осаждения и цветные реакции. Для проведения качественных реакций из растительного сырья готовят водное извлечение. Методики качественного определения. Приготовление извлечения. 1 г измельченного растительного сырья заливают 100 мл воды. Нагревают на водяной бане 20-30 мин, процеживают через вату и полученное извлечение используют для проведения качественных реакций. Качественные реакции извлечения. К 2-3 мл извлечения добавляют по каплям 1%-ный раствор желатины. Появляется муть, исчезающая при добавлении избытка желатины. К 2-3 мл извлечения прибавляют несколько капель 1%-ного хлорида хинина (антипирина). Появляется аморфный осадок. При добавлении к 2-3 мл извлечения 4-5 капель раствора железоаммониевых квасцов в случае гидролизуемых дубильных веществ появляется черно-синее окрашивание или осадок, а конденсированных - черно-зеленое окрашивание или осадок (эта реакция используется для открытия дубильных веществ в растительном материале).

К 10 мл извлечения прибавляют 5 мл смеси (2 мл HCl, разведенной в соотношении 1:1, и 3 мл 40%-ного раствора формальдегида). Полученную смесь кипятят 30 мин в колбе, снабженной обратным холодильником. При наличии конденсированных дубильных веществ они выпадают в осадок. Осадок отфильтровывают. К 2 мл фильтрата добавляют 10 капель 1%-ных железоаммониевых квасцов и около 0,2 г кристаллического ацетата свинца, раствор перемешивают. В случае наличия гидролизуемых дубильных веществ появляется синее или фиолетовое окрашивание (в нейтральной среде). К 2-3 мл извлечения прибавляют по каплям бромную воду (5 г брома в 1 л воды) до того момента, когда в жидкости станет ощущаться запах брома. При наличии конденсированных дубильных веществ сразу образуется осадок. К 1 мл извлечения добавляют 2 мл 10%-ной уксусной кислоты и 1 мл 10%-ной средней соли ацетата свинца - гидролизуемые дубильные вещества образуют осадок. При наличии конденсированных дубильных веществ фильтрат окрасится в черно-зеленый цвет от прибавления 5 капель 1%-ных железоаммониевых квасцов и 0,1 г ацетата свинца. К 2 мл извлечения прибавляют несколько кристаллов NaNО₃ и 2 капли 0,1 н. HCl. При наличии гидролизуемых дубильных веществ появляется коричневое окрашивание. Хроматографическое определение (катехинов листа чая и коры акации катеху ТСХ). 0,1 г измельченного сырья заливают 2 мл 95 %-иого этилового спирта и нагревают на водяной бане до кипения, охлаждают, фильтруют. Полученный этанольный экстракт наносят с помощью капилляра на стартовую линию хроматографической пластинки "Силуфол" (высота столбика жидкости в капилляре 1,5-2 см; диаметр пятна на стартовой линии не более 5 мм), Рядом с исследуемым экстрактом на стартовую линяю наносят в качестве "свидетеля" раствор очищенной суммы катехинов листа чая. После высушивания пластинку помещают в хроматографическую камеру с системой растворителей м-бутанол - уксусная кислота - вода (40:12:28). Хроматографирование проводят в течение 1,5 ч (пробег фронта растворителя 10-12 см). Затем хроматограмму высушивают на воздухе и обрабатывают раствором 1 %-ного ванилина в концентрированной HCl. Катехины проявляются в виде красно-оранжевых пятен.

Количественное определение

 

В литературе описано около 100 различных способов количественного определения дубильных веществ, которые можно подразделить на следующие основные группы:

1. Гравиметрические - основаны на количественном осаждении дубильных веществ желатиной, нонами тяжелых металлов или адсорбцией гольевым порошком.

2. Титрометрические - на окислительных реакциях, прежде неего с применением перманганата калия (метод ГФ X).

.   Фотоколориметрические - на реакциях с солями окисного железа, фосфорновольфрамовой кислотой, с реактивом Фолина - Дениса и др.

.   Методы нефелометрические, хроматоспектрофотометрнческие в основном используются в исследованиях.

Стандартным для технических целей является гравиметрический метод с применением гольевого порошка (весовой единый метод (ВЕМ)). В ГФ X входит титрометрический метод Левенталя в модификации А. Л. Курсанова, основанный на способности дубильных веществ быстро окисляться перманганатом калия. Для количественного определения танина в листьях скумпии и сумаха предложен метод осаждения дубильных веществ сульфатом цинка с последующим комплексонометрическим титрованием. Для количественного определения катехинов в листе чая и коре акации катеху М. Н. Запрометовым разработан фотоколориметрический метод с использованием бумажной хроматографии для разделения катехинов и реакции катехинов с 1%-ным ванилином в концентрированной НС1, в результате которой образуется окрашенный раствор.