Воздух жидкости поверхности

                                                                                                                                                                           СМЫВ

СЕДИМЕНТАЦИЯ                       СИЛЬНО ЗАГРЯЗНЕННЫЕ

           ФИЛЬТРОВАНИЕ                                                        СЛАБО ЗАГРЯЗНЕННЫЕ

           (аппарат Кротова)

 

                                           последовательные   непосредственное    исследование

                        разведения               исследование           суспензии

 

ПОСЕВ МИКРОФЛОРЫ ВОЗДУХА

 

Одним из простейших методов взятия проб воздуха является метод седиментации

 

3. Выделение чистых культур микроорганизмов. Посев на скошенный МПА. Изучение культуральных и морфологических свойств микробов. Основные морфологические формы бактерий. Методы приготовления и окрашивания фиксированных препаратов. Простые и сложные методы окрашивания препаратов.

 

Выше мы уже отметили, что проведение бактериологического анализа предполагает определение видовой принадлежности выделенных культур – их идентификацию. Однако прежде необходимо получить чистые культуры микроорганизмов.

Чистой культурой микроба называется такая культура, которая состоит из особей только одного определенного вида. Во внешней среде и в организме человека микробы чаще всего встречаются в смеси с другими микробами. Для изучения свойств того или иного микроба (без чего не может быть поставлен диагноз) его нужно иметь в чистой культуре, т. е. приходится отделять его от других микробов, с которыми он смешан. Методов выделения чистых культур существует в основном три: а) посев на чашку Петри, б) посев на элективную (избирательную) среду, в) выделение культуры из организма животного, чувствительного к тому или иному микроорганизму.

Посев в чашку Петри имеет целью получить изолированные друг от друга совокупности клеток, определенного вида, - колонии. Посев производят разными способами: либо петлей, либо стеклянным шпателем (шпатель Дригальского). Посев петлей производят следующим образом. Берут петлей небольшое количество культурального материала, легко проводят по поверхности агара нанося ряд линий. Той же петлей, не набирая материала вновь наносят штрихи на второй и третьей чашке с агаром. На первой чашке может получиться сплошной рост, тогда как на второй и на третьей наблюдается рост единичных, изолированных колоний. Каждая колония представляет обособленное скопление однородных клеток микробов. При последующем пересеве из колоний на косой агар или другую питательную среду получают чистую культуру

РИСУНОК111115

РИСУНОК 16

При посеве шпателем на поверхность агара наносят петлей одну каплю исследуемого материала. Затем, приоткрыв чашку, прокаленным и остуженным стеклянным шпателем размазывают каплю по всей поверхности, производя легкие поглаживающие движения во все стороны по поверхности агара. Не обжигая шпателя, им же засевают вторую и третью чашку. Для получения относительных количественных характеристик исследуемой суспензии на поверхность среды наносят мерное количество бактериальной суспензии с определенной концентрацией клеток. Для этого используют мерные пипетки. Обычно в первых двух чашках после инкубации наблюдают сплошной рост микроорганизмов, тогда как в последующих - изолированные колонии.

РИСУНОК 12

После посева чашки помещают в термостат крышками вниз, чтобы конденсационная вода, образовавшаяся на крышке чашки Петри при застывании агара, не помешала получить изолированные колонии. Чашки выдерживают в термостате в течение 1-7 суток в зависимости от скорости роста микроорганизмов. Отдельно выросшие колонии пересевают бактериологической иглой, простерилизованной в пламени горелки и остуженной на воздухе, на свежую стерильную среду (чаще всего скошенный агар в пробирке).

Изолированные колонии анаэробных микроорганизмов получают методом глубинного посева, известного как метод последовательных разведений. Для этого плотную питательную среду предварительно разливают в пробирки по 15-20 мл и стерилизуют. Непосредственно перед посевом пробирки помещают в кипящую водяную баню, чтобы из среды удалить кислород. Высев в пробирки производят из нескольких последовательных разведений бактериальной суспензии в стерильной водопроводной воде. Для этого в пробирку с расплавленной и остуженной до 48-50° агаризованной средой вносят 0, 5-1, 0 мл одного из разведений бактериальной суспензии. Посевной материал тщательно перемешивают, вращая пробирку между ладонями. Затем около пламени горелки вынимают из пробирки пробку, обжигая края пробирки в пламени горелки, и быстро выливают содержимое пробирки в чашку Петри. После того, как агаризованная среда застынет, чашки Петри помещают в термостат. Колонии выросшие в толще среды, вырезают стерильным скальпелем или извлекают стерильными капиллярными трубками, или простой петлей и переносят в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР. Для классификации и идентификации культур выделенные микробы подвергаются детальному изучению. Характеристика данного микроба складывается из морфологических (1), культуральных (2), биохимических и серологических (3) признаков, которые позволяют его идентифицировать, т. е. определить его видовую принадлежность.

Морфологические свойства определяются путем бактериоскопии окрашенных мазков и изучения микробов в живом виде (висячая капля). При микроскопировании обращают внимание на форму микроба, его расположение, величину, наличие спор, капсул, отношение к тем или иным методам окраски.

Культуральные свойства – это морфологические свойства совокупности клеток микроорганизмов, выросшей на определенном субстрате. Обращают внимание на форму и размер колоний, их цвет, консистенцию и др.

Биохимические свойства. Для более точного определения вида применяют более тонкие исследования, т. е. изучают биохимические свойства микробов. При этом определяют отношение микроба к кислороду, его ферментативные и редуцирующие свойства, образование в культурах определенных продуктов обмена и изменение реакции среды.

 

ОСНОВНЫЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ГРУППЫ БАКТЕРИЙ. Бактерии представляют собой микроскопические организмы, измеряемые микронами (микрон равен 0,001 мм). Размножаются при помощи простого поперечного деления. Величина бактерий незначительна, в среднем она колеблется от 0,5 до б мкм. В капле воды может находиться несколько миллионов микробов. Бактерии по своей форме разделяются на три основные группы, хотя их морфологическое разнообразие значительно богаче. К первой группе относятся микробы, имеющие шаровидную форму, — кокки, ко второй — имеющие форму палочек, т. е. микробы, у которых длина больше, чем ширина. Наконец, к третьей группе относятся извитые формы — вибрионы, спирохеты и спириллы.

а) Кокки имеют форму шара. В процессе деления новые молодые клетки могут образовывать специфические скопления. По взаимному расположению клеток кокки подразделяются на следующие морфологические группы (рис. 1):

- монококки – клетки располагающиеся по одной, изолированно друг от друга;

- диплококки, или парные кокки, – клетки, располагающиеся попарно;

- стрептококки — соединение отдельных кокков в виде цепочек;

- сарцины — группа кокков, клетки которых образуют плотно упакованные угловатые скопления, напоминающие кубики или перевязанные тюки;

- стафилококки — скопление кокков, напоминающее виноградные кисти или рассыпанный виноград.

Однако среди кокков встречаются такие, которые не имеют форму правильных шаров. Так, возбудитель гонорреи — гонококк — имеет бобовидную форму, возбудитель крупозного воспаления легких — пневмококк — ланцетовидную форму. Кроме того необходимо отметить что форма клеток многих бактерий может меняться в зависимости от их физиологического состояния.

РИСУНОК 2

Рис. 2. Бактерии. Круглые формы.

1 — микрококки; 2 — диплококки; 3 — стрептококки; 4 — тетракокки; 5 — сарцины; 6 — стафилококки.

б) Палочки. К. этой группе относятся микробы, имеющие форму цилиндрических клеток. Те из них, которые образуют споры, называются бациллами, не образующие спор — бактериями. Палочки, подобно коккам, могут давать различные сочетания: палочки, соединенные по две, носят название диплобацилл, или диплобактерий; палочки, соединенные в цепочку, образуют стрептобациллы, или стрептобактерии (рис. 3).

РИСУНОК 3

 

Рис.3

 

У одних палочек концы закругленные, у других— прямые, у третьих — заостренные. Спорообразующие бактерии могут различаться по форме и расположению споры в клетке, по образующемся или нет вздутию клетки вокруг споры и т.д. Так, можно различать округлые и эллипсовидные споры, расположенные терминально, субтерминально и центрально.(Рис.4)

 

РИСУНОК 4 СПОРЫ

 

Рис.4 терминальное          субтерминальное           центральное

 

 

в) К третьей группе относятся бактерии, извитые в виде спирали. Среди них различают палочки, слегка изогнутые в виде запятой — вибрионы; спирально извитые микроорганизмы —спириллы и спирохеты (рис. 4).

РИСУНОК 5

 

Рис. 5. Извитые формы.

1 — холерный вибрион; 2 — спирилла; 3 — спирохета возвратного тифа; 4 — спирохеты сифилиса.

 

Полиморфизм бактерий. Форма и величина бактерий могут меняться в зависимости от условий питания, культивирования и воздействия различных физических и биохимических факторов. Так, например, холерный вибрион в старых культурах может принимать форму шаров, гигантских спирилл, амеб и т. д. Туберкулезная палочка обладает склонностью давать ветвистые формы, а дифтерийной палочке свойственно ветвление и образование на концах булавовидных вздутий. Такое отклонение от обычной формы и размера у микробов носит название полиморфизма.

РИСУНОК6 РИСУНОК 7

Однако, прежде чем изучать морфологические свойства бактерий, обычно исследуют культуральные признаки и отсевают клетки в стерильную среду для дальнейшего культивирования. Это продиктовано тем, что для приготовления препарата приходится многократно открывать емкости в которых развиваются колонии бактерий, а это неминуемо способствует проникновению посторонних микробов и загрязнению исследуемых культур.