Глава 2 Иммобилизованные клетки микроорганизмов

 

Если с 60-х годов нашего столетия началось изучение возможностей иммобилизованных ферментов, то спустя 10 лет начали появляться публикации, касающиеся иммобилизации целых клеток микроорганизмов. Многие примеры иммобилизованных клеток можно найти в природе (прикрепленная микрофлора почв, водоемов и т.д.), в технологическом процессе еще 150 лет назад для получения уксуса были использованы микроорганизмы, закрепленные на древесных стружках.

Иммобилизации могут подвергаться клетки в различных состояниях, т.е. живые, поврежденные в различной степени и мертвые, выбор зависит от типа катализируемых реакций. Так, многостадийные процессы, происходящие с участием различных ферментов и таких коферментов, как АТФ, НАД, НАДФ, ФАД и др., осуществляются только живыми клетками, тогда как одностадийные реакции можно проводить с помощью поврежденных и даже мертвых клеток.

Большой интерес к иммобилизованным клеткам связан с тем, что, как и иммобилизованные ферменты, они более стабильны, технологичны по сравнению со свободными клетками, продукты, полученные с применением биореакторов с иммобилизованными клетками, легче отделяются от катализатора. Но, они имеют ряд преимуществ и по сравнению с иммобилизованными ферментами, которые заключаются в следующем:
- отсутствие затрат на выделение и очистку ферментов;
- способность к длительному функционированию полиферментных систем без экзогенных кофакторов;
- более высокая активность и стабильность иммобилизованных клеток, связанная с тем, что ферменты в клетках микроорганизмов находятся в естественном окружении и потому их нативная стерическая организация сохраняется;
- иммобилизация микробных клеток дает возможность осуществлять непрерывный процесс без вымывания клеток и изменения их генетической природы, а в некоторых случаях позволяет постоянно отделять продукт и удалять ингибирующие вещества.

 

Методы иммобилизации клеток микроорганизмов

 

Различают химические, физические и механические методы иммобилизации клеток.

 

Химические методы (ковалентное и поперечное связывание)

Эти методы основаны на образовании ковалентных связей между реакционноспособными группами носителя. Обычно используемые бифункциональные реагенты токсичны для живых клеток, поэтому непосредственный контакт клеток с ними нежелателен. Избежать этого можно, проводя обработку носителя такими веществами, как гексаметилендиамин, карбодиимид и др., до прикрепления клеток. Поврежденные или мертвые клетки, катализирующие одностадийные процессы, например, изомеризацию глюкозы, привязывают друг к другу с помощью полифункциональных агентов типа альдегидов или аминов. Такую процедуру называют химическим поперечным связыванием. Показано, что в биореакторе глюкоизомеразная активность поперечносшитых клеток Streptomyces olivaceus сохраняется постоянной до 40 суток.

В целом, для живых клеток химические методы мало пригодны и поэтому используются редко.

 

Механические методы

Механические методы иммобилизации основаны на включении микробных клеток в различные гели и мембраны. При включении в гели клетки оказываются заключенными в ячейки полимерной сетки, проницаемой для субстрата, ноне для самих клеток. Как и в случае ферментов, процедуру включения проводят либо в процессе реакции полимеризации (ПААГ), либо при гелеобразовании раствора полимера (альгинат, каррагинан и др.), либо пропитывая готовый блок геля клеточной суспензией.

Наиболее универсальным и широко используемым методом иммобилизации клеток является включение их в ПААГ, которое при любом способе гарантирует равномерное распределение клеток по внешнему объему носителя. Обычно применяют гель в виде гранул, полученных механическим дроблением через сито с ячейками необходимого размера. Его преимущества - это простота приготовления, относительная дешевизна, возможность включать клетки любого размера в любом количестве, достаточная фиксация клеток, прочность гранул на истирание, инертность по отношению к действию микроорганизмов.

Известны примеры включения в гель, образованный производными циркония. Но, поскольку процесс гелеобразования протекает при рН 2-5, такие носители применимы лишь для кислотоустойчивых бактерий.

Японскими учеными предложен способ иммобилизации клеток в каррагинановый гель. Каррагинан - полисахарид, в процессе гелеобразования участвуют одновалентные ионы металлов.

Примером "мягкой" иммобилизации является включение клеток в альгинатные гели. Такой взгляд основан на том, что альгинат- природный полисахарид, выделенный из морских водорослей и состоящий из остатков Д-маннуроновой кислоты, индифферентен по отношению к микроорганизмам, т.к. основан на образовании ионных связей между линейным полиэлектролитом(альгинатом натрия) и поливалентным противоионом (обычно ионы кальция) и протекает при достаточно низких температурах.

Клетки, включенные в полисахаридные гели, сохраняют жизнеспособность в течение длительного времени и в питательной среде могут размножаться в поверхностных слоях полимера. Способность этих гелей к растворению дает возможность вести количественный учет клеток, находящихся в ячейках. Недостатком является то, что большинство полисахаридных гелей демонстрируют низкую механическую прочность.

Клетки микроорганизмов включают в другие гели- поливиниловый спирт, триацетат, жидкостные мембраны и т.д.

Клетки микроорганизмов, включенные в различные гели нашли применение в биотехнологии:

В ИФБМ РАН с 1972 г. ведутся работы по использованию иммобилизованных клеток A.globiformis для трансформации стероидов. Сравнение 10 различных методов выявило, что лучшие результаты дает включение в ПААГ и крупнопористые носители. Период полужизни ферментативной активности составил 5 месяцев. С 1974 года фирма "Танабэ Сейяко" (Япония) приступила к промышленному выпуску яблочной кислоты с использованием включенных в ПААГ клеток Brevibacterium ammoniagenes. В 1978 году ПААГ был заменен каррагинаном, что позволило увеличить эффективность биокатализатора в 2,3 раза, а замена штамма на более активный увеличила этот показатель еще в 5 раз. Это привело к тому, что стало возможным с помощью однократного приготовления гранул получать в непрерывных условиях до 100 т яблочной кислоты. Ферментативная активность иммобилизованных клеток используется для очистки сточных вод, и для извлечения из них тяжелых металлов. Показано, что 10 г клеток Alcaligenes eutrophus (сырая биомасса), иммобилизованных в каррагинановый или альгинатный гели, при очитке сточных вод от трития эквивалентны 1 г платинового катализатора.

 

Физические методы

К физическим методам относятся адсорбция и агрегация. Иммобилизация микробных клеток методом сорбции уже более 100 лет применяется в процессах сбраживания углеводов до этанола, окислениях этанола до ацетата и др. В 40-х годах ХХ века началось использование адсорбированных клеток микроорганизмов для очистки сточных вод, а затем для биологической очистки воздуха, синтеза ценных химических веществ, производства пластмассы, извлечения цветных металлов из бедных руд и др.

В качестве адсорбентов могут быть использованы различные органические и неорганические носители - различные полимеры, керамика, глины. Развитие полимерной химии на современном этапе позволяет обоснованно модифицировать или целенаправленно синтезировать пористые сорбенты с заданной проницаемостью, гидрофильностью и набором определенных функциональных групп на поверхности, отличающиеся высокой химической стойкостью и достаточной для проведения термической стерилизации термостойкостью.

Физические методы иммобилизации основаны на способности клеток слипаться друг с другом или адсорбироваться на подходящих поверхностях. Степень закрепления клеток на носителе зависит от химической природы адсорбента, его формы, характера клеточной поверхности и условий проведения процедур иммобилизации.

Проведя аналогии с иммобилизацией ферментов, многие ученые считали, что физическая сорбция клеток на носителе не может обеспечить ни высокой клеточной нагрузки, ни прочного связывания биологического материала с адсорбентом. Однако, в ряде работ было показано, что при определенных условиях адгезионной иммобилизацией можно практически необратимо сорбировать на 1 г носителя до 1 г влажной биомассы клеток. Причем, даже при высокой скорости потока субстрата клетки удерживаются на поверхности сорбента. В настоящее время в большинстве крупномасштабных микробиологических процессов используются клетки, сорбированные на различных носителях, что связано с такими преимуществами адгезионной иммобилизации, как дешевизна, универсальность, отсутствие стрессовых воздействий на клетки и простота осуществления.