Нуклеопротеиды. Выделение нуклеопротеидов из дрожжей и определение их состава.

Нуклеопротеиды - сложные белки, простетической группой которых являются нуклеиновые кислоты (дезоксирибонуклеиновая - ДНК и рибонуклеиновая - РНК). Они представляют собой слож­ные агрегаты, построенные из 1-2 молекул нуклеиновой кислоты и большого числа прикрепленных к ним белковых субъединиц. Связь между белком и нуклеиновыми кислотами осуществляется за счет ионных, водородных и гидрофобных взаимо­действий.

Нуклеиновые кислоты характеризуют­ся определенным составом и распадаются:

- при неполном ферментатив­ном гидролизе РНК и ДНК, щелочном гидролизе РНК (ДНК не гидролизуются под действием щелочей) до структурных единиц нуклеиновых кислот – мононуклеотидов.

- при полном гидролизе мононуклеотидов до пуриновых (аденина, гуанина) и пиримидиновых (цитозина, тимина – только в ДНК, урацила – только в РНК) азотистых оснований, пентоз (рибозы – в РНК, дезоксирибозы – в ДНК) и фосфорной кислоты.

Нуклеопротеидами богаты печень, селезенка, поджелудочная железа, почки. Доступным и удобным объектом, особенно богатым нуклеопротеидами, являются дрожжи. Нуклеопротеиды извлекаются из дрожжевых клеток при механическом разрушении клеток. Дальнейшее их выделение связано со свойством нуклеопротеидов растворяться в разбавленных растворах щелочей и легко осаждаться при подкислении раствора. При непродолжительном гидролизе дрожжевой массы или выделенных из нее нуклеопротеидов последние распадаются на полипептиды, пуриновые и пиримидиновые основания, рибозу и дезоксирибозу, фосфорную кислоту.

Продукты гидролиза нуклеопротеидов могут быть обнаружены в гидролизате специфическими для каждого соединения реакциями.

Реактивы и оборудование: дрожжи, диэтиловый эфир, 5%-ный раствор уксусной кислоты, 0,4, 10, 30%-ные растворы гидроксида натрия, 10%-ный раствор серной кислоты, 25%-ный раствор аммиака, 1%-ный раствор нитрата серебра, 1, 7%-ные растворы сульфата меди, этанол, молибденовый реактив (3,75 г молибдата аммония растворяют в 50 мл воды и добавляют 50 мл 32%-ного раствора азотной кислоты), ступки с пестиками, центрифуга, центрифужные пробирки, технические весы, пипетки, стеклянный лом, стеклянные палочки, фарфоровые чашки, бумажные фильтры, воронки, воздушный холодильник, электрическая плитка, спиртовки, пробирки.

Выполнение работы.

I. Извлечение нуклеопротеидов из дрожжей.

Навеску 1 г сухих дрожжей помещают в ступку, добавляют туда 0,5 г стеклянного лома, диэтилового эфира и воды по каплям и тщательно растирают до образования пластичной массы. Затем в ступку добавляют 5 мл 0,4%-ного раствора едкого натрия и продолжают растирать еще в течение 15-20 минут. Содержимое ступки центрифугируют в течение 10 минут (при 2000 оборотах в минуту). После центрифугирования надосадочную жидкость осторожно пипеткой переносят в фарфоровую чашку и по каплям прибавляют 2 мл 5%-ного раствора уксусной кислоты. При добавлении уксусной кислоты происходит выпадение нуклеопротеидов в осадок, который отделяют центрифугированием. Затем надосадочную жидкость сливают, а осадок используют для дальнейшего гидролиза.

II. Кислотный гидролиз нуклеопротеидов.

В колбу для гидролиза (с обратным воздушным холодильником) помещают осадок нуклеопротеидов, заливают 10-15 мл 10%-ного раствора серной кислоты и кипятят в течение 1,5 ч, поддерживая только слабое кипение. После кипячения колбу охлаждают, содержимое ее фильтруют через бумажный фильтр, а фильтрат подвергают дальнейшему анализу.

III. Анализ гидролизата.

Охлажденный гидролизат используют для качественного анализа на полипептиды, пуриновые основания, пентозы и фосфорную кислоту.

Белки обнаруживают с помощью биуретовой реакции.

Пуриновые основания обнаруживают по их реакции с аммиачным раствором нитрата серебра.

10 капель гидролизата нейтрализуют по каплям 25%-ным раствором аммиака (до рН=4 по универсальному индикатору, так как серебрянный комплекс пуриновых оснований выпадает в слабокислой среде) и затем добавляют 5 капель 1%-ного раствора нитрата серебра. Наблюдается образование комплекса серебра с пуриновыми основаниями в виде желтовато-белого аморфного осадка.

Пентозы обнаруживают по реакции Троммера.

5 капель гидролизата нейтрализуют 15 каплями 30%-ного раствора гидроксида натрия (до рН=9), затем добавляют 1 каплю 7%-ного раствора сульфата меди (избыток сульфата меди меняет окраску). Раствор при этом окрашивается в фиолетовый цвет, так как образуется алкоголят меди. Пробирку с раствором нагревают до кипения и наблюдают выпадение бурого осадка, так как медь (II) окисляется до оксида меди (I), имеющего красно-кирпичный цвет.

Фосфорную кислоту обнаруживают по реакции с молибдатом аммония:

12(NH₄)₂MoO₄ + H₃PO₄ + 21HNO₃ → (NH₄)₃PO₄·12MoO₃↓ + 21NH₄NO₃ + 12H₂O.

К 1-2 мл гидролизата приливают 2-3 мл молибденового реактива, нагревают до кипения. Образуется желтый осадок фосфоромолибдата аммония (NH₄)₃PO₄·12MoO₃.

Контрольные вопросы.

1. Что такое нуклеопротеиды? К какому классу биомолекул они относятся?

2. В каких участках клетки локализуются нуклеопротеиды?

3. При каких условиях нуклеопротеиды распадаются на нуклеиновые кислоты и белки?

4. Какие продукты полного гидролиза нуклеопротедов? Какими качественными реакциями их можно обнаружить?

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 6.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ

В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ.

 

Для количественного определения белков применяют биологические, физические и химические методы.

Биологические методы количественного определения белков основаны на измерении степени биологической активности препарата и, поэтому, применимы лишь к белкам, обладающим ферментативной и гормональной активностью. Эти методы не дают абсолютных результатов.

Более точными являются физические методы количественного определения белков. Наибольшее распространение из них получили три: рефрактометрический (по показателю преломления белковых растворов), спектрофотометрический (по интенсивности светопоглощения в ультрафиолетовой области спектра) и полярографический (по полярографическим кривым, показывающим зависимость между силой тока и напряжением, приложенным к системе, содержащей белок).

Химические методы количественного определения белков разнообразны. Самым распространенным и наиболее точным является фотоколориметрический метод. Он основан на измерении интенсивности светопоглощения, которая зависит от количества белка в исследуемой пробе.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ

РЕФРАКТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

Рефрактометрический метод анализа белка основан на измерении показателя преломления белкового раствора, зависящего от его кон­центрации, температуры, длины волны падающего света и природы ве­щества.

Между показателем преломления (n) и концентрацией белка в растворе характерна прямо пропорциональная зависимость. Поэтому концентрацию белка в исследуемом растворе находят по показателю преломления с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартному раствору белка.

Измерения проводят с помощью специального прибора – рефрактометра, с устройством которого можно ознакомиться по инструкции, прилагаемой к прибору.

Реактивы и оборудование: стандартный раствор белка, раствор исследуемого белка, рефрактометр, пипетки мерные на 1, 2, 5 мл, колба мерная на 100 мл, стеклянные палочки, фильтровальная бумага.

Выполнение работы. В колбах на 100 мл готовят серию (5-6) стандартных растворов белка с концентрациями 1 – 8 мг/мл, измеряют их показатели преломления (n) с помощью реф­рактометра, предварительно установив ноль по воде (показатель преломления воды при температуре 20°С равен 1,333). Если во время проведения измерений температура не равна 20°С, то в полученное значение показателя преломления вносят поправку 0.0001 на каждый градус. В случае более низкой температуры поправку вычитают, более высокой – прибавляют. После этого строят график зависимости в координатах n - f (c). Затем, измерив показатель преломления исследуемого раствора, по построенной калибровочной кривой определяют его концент­рацию. Результат пересчитывают на 100 г продукта.