Тема: Бактериофаг. Фазы взаимодействия фага с бактериальной клеткой. Практическое применение явления бактериофагии.

Цель занятия: изучить строение и свойства вирулентных и умеренных бактериофагов, их взаимодействие с бактериальной клеткой, освоить качественные и количественные методы определения фагов.

План занятия

1. Строение и свойства бактериофага.

2. Вирулентные и умеренные фаги. Их отличия.

3. Взаимодействие вирулентного фага с бактериальной клеткой.

4. Умеренный бактериофаг. Явление лизогении и фаговой конверсии.

5. Применение бактериофага в практической медицине. Методы выделения фага из объектов окружающей среды.

6. Качественные  и количественные методы определения фагов.

7. Фаготипирование бактерий.

Задания для выполнения лабораторной работы.

 

1. Провести опыт титрования бактриофага методом Аппельмана. Учесть результат по демонстрационным препаратам.

Титрование бактериофага на жидких средах (метод Аппельмана).

       В десять пробирок помещают по 4,5 МПБ. В первую вносят 0,5 мл фага (разведение 10^-1), затем берут 0,5 мл и переносят во вторую (разведение 10^-2) и т.д. до десятой пробирки (разведение 10^-10). Далее в них вносят по 1 капле культуры кишечной палочки, помещают в термостат и через сутки проводят учет результатов. В пробирках, где оказался хотя бы один фаг, роста культуры не будет. Титр фага – то последнее разведение, в котором произошел лизис микроорганизмов (обозначается (10^-4 и т.д.). 

2. Определить специфичность бактериофага методом Отто. Учесть результаты по демонстрационным препаратам.

Определение специфичности бактериофага (метод Отто).

       Растопленный 3% мясо-пептонный агар разливают в стерильные чашки Петри. Охлажденные чашки Петри подсушивают в термостате в течение 10-15 мин. На поверхность питательной среды засевают «газоном» бульонную культуру бактерий, гомологичных искомому бактериофагу, наносят каплю известного фага или исследуемого фильтрата, чашку наклоняют и дают капле фага стечь по противоположному краю. Чашки инкубируют в термостате 16-18 часов и учитывают результат. Если фаг гомологичен микроорганизму и биологически активен, то по пути стекания капли роста микробов не будет, среда останется прозрачной.

Репродукция вирулентного фага в клетках бульонной бактериальной культуры сопровождается их лизисом и просветлением среды. На газоне чувствительных бактерий, выращенных на агаровой среде в чашке Петри, фаги образуют зоны очагового или сплошного лизиса, что зависит от их концентрации. Зоны очагового лизиса получили название негативных колоний фага или стерильных пятен (бляшек).

Рис. 11. Лизис культуры стафилококка            Рис. 12. Лизис бульонной культуры        

Специфическим бактериофагом                    E. coli специфическим бактериофагом

                              

                              

       Большинство фагов характеризуется видовой специфичностью в отношении бактерий. Однако существуют фаги, способные поражать только отдельные варианты одного и того же вида бактерий. Их используют для определения фаговаров (фаготипов) внутри данного вида.

           

Вопросы для обсуждения.

1. Строение бактериофага. 2. Свойства бактериофага. 3. Отличия вирулентного и умеренного бактериофага. 4. Взаимодействие вирулентного бактериофага с бактериальной клеткой. 5. Особенности взаимодействия умеренного бактериофага с микробной клеткой. 6. Явление лизогении и фаговой конверсии. 7. Применение бактериофага в практической медицине. 8. Методы выделения фага из объектов окружающей среды. 9. Качественные методы определения фагов. 10. Количественные методы определения фагов. 11. Определение спектра литического действия фага. 12. Фаготипирование бактерий. 13. Определение лизогении.

 

Дополнительный материал.

Рис. 13. Структура фага

 

                                                                     

 

Таблица 9

Классификация фагов по форме

 

1	2	3	4	5	6
Нитевидные	С аналогом отростка	Без отростка	С коротким отростком	С длинным отростком	С длинным отростком и сокращающимся чехлом

 

Рис. 14. Адсорбция частиц фага на поверхности клеток

 

 

Этапы взаимодействия бактериофага с бактериальной клеткой

1. Адсорбция                                                                     4. Сборка                                        

2. Проникновение нуклеиновой кислоты                       5. Выход

3. Репродукция (синтез нуклеиновой кислоты и белка)

Оформление лабораторной тетради.

 

Зарисовать схему титрования фага по Аппельману и отметить полученный результат; записать результат определения специфичности бактериофага методом Отто.

 

ЗАНЯТИЕ № 11