Тема: Генетические рекомбинации у бактерий. Внехромосомные факторы наследственности.

Цель занятия: познакомиться с процессами обмена генетической информацией у бактерий, изучить явления трансформации, коньюгации и трансдукции в бактериальных клетках, оценить роль умеренного бактериофага в переносе генетической информации, определить роль внехромосомных генетических элементов для бактерий.

 

План занятия.

1. Рекомбинация – обмен генетической информацией.

2. Трансформация, ее механизм, основные этапы.

3. Коньюгация. Роль полового фактора. F⁺, F־, Hfr-клетки.

4. Трансдукция, ее механизм. Роль умеренного бактериофага.

5. Плазмиды бактерий – внехромосомные генетические элементы: строение, классификация, функции.

Задания для выполнения лабораторной работы.

1. Провести опыт по трансформации бактерий:

1) сделать смыв культуры сенной палочки (ауксотрофный штамм, нуждающийся в треонине) и разлить по 0,5 мл в две стерильные пробирки;

2) в первую пробирку добавить о,5 мл раствора ДНК прототрофного штамма, во вторую – 0,5 мл физиологического раствора, поставить в термостат на 30 мин;

3) произвести посев (по 0,1 мл) на чашки с минимальной средой;

4) по демонстрационным посевам учесть рост микробов, записать результат.

       Ауксотрофные штаммы микроорганизмов, в отличие от прототрофных, требуют наличия определенных питательных веществ в среде, поскольку сами их синтезировать не могут. На минимальной питательной среде они не растут.

       На питательной среде, где сделан посев сенной палочки или ДНК, роста колоний не будет. В третьем секторе, если произошла трансформация и бактерии получили фрагмент ДНК с информацией о ферменте триптофансинтетазе, произойдет рост микроорганизмов.

2. Провести опыт коньюгации:

1) сделать смыв культур E. coli тиминзависимого штамма (Hfr-клетки) и штамма E. coli (F־), нуждающегося в лейцине;

2) по 0,5 мл суспензии каждого штамма смешать в отдельной пробирке и поставить в термостат на 30 мин;

3) произвести высев препарата на чашку с минимальной средой;

4) по демонстрационным посевам учесть и записать результаты опыта.   

Посев исходных штаммов микроорганизмов на минимальную питательную среду роста не дает, так как не хватает питательных веществ. Если произошла коньюгация, то при посеве смеси вырастут колонии кишечных палочек, получивших от Hfr-клеток ДНК, ответственную за синтез лейцина и треонина.

Рис. 9. Селекция рекомбинанта, полученного под влиянием трансформации (изолированная ДНК), трансдукции (бактериофаг – переносчик ДНК)

 

Рис. 10. Селекция рекомбинанта, полученного путем коньюгации живых бактерий.

Имеет ген резистентности к стрептомицину

3. Изучить постановку опыта по выявлению Col -плазмид.

       Исследования проводят методом отсроченного антагонизма по Фредерику. Испытуемые культуры (например шигеллы Зоне) засевают уколом в 1,5 % мясо-пептонный агар по 4-5 штаммов на одну чашку Петри. После инкубирования в течение 24 ч при 37˚С выросшие макроколонии стерилизуют парами хлороформа. С этой целью чашку размещают вверх дном и на внутреннюю поверхность крышки наносят 4-6 капель хлороформа. Через 30 мин хлороформ удаляют, выдерживая чашки с открытой крышкой 15-20 мин. Затем поверхность агара заливают слоем расплавленного и охлажденного до 48˚С 07 % мясо-пептонного агара (5 мл), предварительно смешанного с 0.1 % мл шестичасовой бульонной культуры индикаторного штамма (например E. coli W1655). После суточной инкубации при 37˚С учитывают результат. Бактерии имеют Col -плазмиду (продуцируют колицин) если вокруг их макроколоний образовались зоны подавления роста индикаторной культуры на фоне ее роста сплошным газоном в остальных участках среды. Идентификацию вида Col -плазмид осуществляют этим же методом, используя коллекцию эталонных индикаторных культур с известной резистентностью или чувствительностью к колицинам.

Вопросы для обсуждения.

1. Рекомбинация – обмен генетической информацией. 2. Типы рекомбинации (общая, «незаконная», сайт-специфицеская). 3. Основные механизмы трансформации. 4. Этапы обмена генетической информацией путем трансформации. 5. Основные механизмы коньюгация. 6. Роль полового фактора. 7. Понятие об F+, F- и Hfr-клетках. 8. Типы передачи генетического материала в процессе коньюгации. 9. Механизмы трансдукции. 10. Роль умеренного бактериофага в процессе трансдукции. 11. Внехромосомные генетические элементы. 12. Строение и функции плазмид. 13. Строение и функции транспозонов и IS-последовательностей.

     

Оформление лабораторной тетради.

 

Зарисовать схемы постановки методов по трансформации, коньюгации и выявления Col -плазмид, записать результаты.

 

ЗАНЯТИЕ № 10