А – Nitrosomonas; Б – Nitrobacter.

Оформление лабораторной тетради.

Зарисовать демонстрационные препараты микроорганизмов, вызывающих процессы аммонификации, нитрификации и денитрификации; зарисовать демонстрационные препараты серобактерий вида Beggiatoa (свободно-плавающие длинные нити) и Thiothrix; зарисовать демонстрационный препарат Bac.megateriam (крупная споровая палочка, соединенная в цепочки); зарисовать чашку Петри со средой Р.А. Менкиной.

ЗАНЯТИЕ № 15

 

 Тема: ИЗУЧЕНИЕ БАКТЕРИЙ КОРНЕВОЙ ЗОНЫ РАСТЕНИЙ.

 

План занятия.

1. Характеристика микроорганизмов ризосферы.

2. Учет бактерий в ризосфере методом Красильникова.

3. Выделение чистых культур клубеньковых бактерий. Определение их активности и вирулентности.

 

Задания для выполнения лабораторной работы.

 

1. Изучить под микроскопом и зарисовать демонстрационные препараты микроорганизмов рода Psendomonas и микробактерий.

В ризосфере развиваются те же формы бактерий, что и в почве, отдаленной от корней. Как правило, на корнях преобладают неспороносные палочки рода Pseudomonas и микробактерии.

Учет бактерий в ризосфере методом Красильникова.

Стерильным пинцетом извлекают корни. Приставшую к корням почву стряхивают в стерильную чашку Петри, берут из нее навеску в 1 г. Навеску помещают в100 мл стерильной водопроводной воды и готовят ряд разведений. По 0,05 мл разведений втирают шпателем в МПА. Выросшие на агаре колонии подсчитывают визуально или при помощи лупы, умножают на соответствующее разведение и получают число микроорганизмов в 1 г почвы. Затем изучают морфологию и культуральные признаки микроорганизмов.

Выделение чистой культуры клубеньковых бактерий

От тщательности промытого корня бобового растения отрезают крупные клубеньки, промывают в стерильной воде и опускают в чашку Петри с 0,1% раствором сулемы. Выдерживают 5 мин, затем переносят клубеньки в чашку Петри со стерильной H₂O, затем переносят в чашку Петри со спиртом, где выдерживают 1 мин. Спирт удаляют обжиганием. Затем клубеньки разрезают стерильным ножом на части. Из содержимого клубенька бактериологической петлей берут взвесь и засевают на агаровую среду Фреда. На этих средах клубеньковые бактерии образуют слизистые, беловатые, непрозрачные колонии, похожие на капли стеарина.

2. Зарисовать в тетрадь выросшие колонии клубеньковых бактерий с демонстрационного препарата.

 

Вопросы для обсуждения.

1. Микрофлора ризосферы. 2. Краткая характеристика основных представителей. 3. Микробиологический анализ образцов ризосферы растений. 4. Метод Красильникова – учет бактерий в ризосфере. 5. Микробиологический анализ поверхности корней (ризопланы). 6. Понятие о вирулентности и активности клубеньковых бактерий. 7. Морфологическая характеристика неспороносных бактерий рода Pseudomonas и микробактерий. 8. Методы выделения чистой культуры клубеньковых бактерий.

 

Дополнительный материал.

Микробиологический анализ образцов ризосферы растений.

При посеве необходимо учитывать, что в ризосфере содержится в десятки, сотни и даже тысячи раз больше микроорганизмов, чем в окружающей почве, поэтому для посева нужно пользоваться большими разведениями. Одновременно делают посев из контрольной почвы (такая же почва, но удаленная от корней растений: почва междурядий или участка, лишенного растительности).

Навеску корней с почвой (5-10 г) помещают в колбу со 100 мл стерильной воды. Суспензию обрабатывают на микроизмельчителе тканей. Посев проводят обычным способом. После посева корни вынимают из колбочки, слегка подсушивают между листами фильтровальной бумаги и взвешивают. По разности в весе корней с почвой и отмытых корней узнают вес ризосферной почвы, взятой для анализа. Расчет количества микроорганизмов ведется на 1 г почвы. Зная ее влажность, можно произвести пересчет количества микроорганизмов на 1 г воздушно-сухой и абсолютно сухой почвы.

Более точные подсчеты можно получить, если после отмывания корней отфильтровать через бумажный фильтр почвенную суспензию, подсушить на воздухе осадок почвы и, исходя уже из его веса, делать пересчет количества микроорганизмов на 1 г почвы.

Микробиологический анализ поверхность корней (ризопланы) по Гузевой и Звягинцеву.

Корни, стерильно отделенные от растения, в течение 5 мин отмывают от ризосферной почвы в колбе со 100 мл стерильной воды корни крючком вынимают из колбы, помещают в стерильную чашку Петри, разрезают на куски в 5-10 мм длиной и после перемешивания отбирают среднюю навеску в 0,5-1 г. Берут не менее трех повторных навесок. Каждую навеску помещают в 100 мл стерильной воды и обрабатывают на микроизмельчителе тканей РТ-2 в течение 5 мин. После минутного отстаивания суспензии готовят разведения и производят посев. Расчет количества микроорганизмов проводят на 1 кг сухих корней или на единицу поверхности корня. Суммарная поверхность корней определяется по поглощению метиленовой сини. Показано, что 1 мг метиленовой сини покрывает 1,05 м² при мономолекулярной адсорбции. Поэтому общую поверхность корневой системы определяют по изменению концентрации раствора сини после погружения в него корней растения.

Для каждого определения наливается раствор метиленовой сини 0,0003 н. в три стакана в десятикратном количестве по отношению к объему корней. Навеску корней для определения поверхности берут параллельно с навеской для микробиологического анализа. В начале корни погружаются последовательно в стаканы с метиленовой синью на 1,5 мин в каждый. После каждого погружения корней они оставляются над каким либо другим стаканом до тех пор, пока раствор краски перестанет с них стекать. Общая поверхность корней (в м²) получается путем умножения 1,05 на количество миллиграммов поглощенной метиленовой сини за первые два погружения корневой системы в раствор краски. Поглощение метиленовой сини определяют колориметрически по изменению концентрации раствора. Для этого готовят образцовый раствор из краски, предварительно высушенной до постоянного веса при 100˚. Молекулярный вес метиленовой сини равен 373, 68 г.

Для сравнения количества микроорганизмов в ризосферной почве и на поверхности корней необходимо количество микроорганизмов в ризосфере пересчитать также на единицу поверхности почвенных частиц. Удельную поверхность почвы также определяют по поглощению метиленовой сини.

 

Оформление лабораторной тетради.

 

Зарисовать колонии клубеньковых бактерий с демонстрационного препарата.

 

ЗАНЯТИЕ № 16