Микробиологическая диагностика .  материалом для исследования является пленка с миндалин

 Материалом для исследования является пленка с миндалин, дужек, неба, язычка, слизь с зева и носам, выделения из глаза, уха, раны, влагалища, пораженного участка кожи. По требованию эпидемиолога исследуют смывы с игрушек и других предметов, некоторые пищевые продукты (молоко, мороженое и тому подобное). Материал нужно брать к началу этиотропного лечения натощак или через 2 час после приема еды.

Для взятия материала используют тампоны, сухие или предварительно смоченные 5 % раствором глицерина, помещенные в пробирку и простерилизированные вместе с ней. Исследуемый материал из ротоглотки и носа берут двумя отдельными тампонами, пытаясь взять его на грани здорового и пораженного участка вращательными движениями, не касаясь тампоном слизистой щек, зубов и языка, который прижимают шпателем. При ларингоскопии пленку или слизь берут непосредственно из гортани. Пленки и слизь из рта и носа берут обязательно во всех случаях, даже при дифтерии других локализаций (кожа, рана, глаз, ухо, вульва). Если необходимо провести первичную бактериоскопию по требованию врача, материал берут отдельным (дополнительным) тампоном или направляют часть снятой пленки, тщательным образом растертой между двумя предметными стеклами. Тампоны после забора материала помещают в те же пробирки, на которых надписывают номер, дату и время забора, фамилию врача. Они должны быть доставлены в лабораторию не позже 3-х час после взятия материала. Если схема забора предусматривает посев возле кровати больного, то пробирки и чашки с посевами немедленно направляют в лабораторию или инкубируют при 37 °С и доставляют через 20-23 час, в холодную пору в сумках с грелками.

Бактериоскопическое исследование. Мазки окрашивают по Граму, Леффлеру и Нейссеру. Можно также красить их уксуснокислым метиловым фиолетовым, толуидиновым синим или бентиазоловым и тиазиновым красителями.

Бактериологическое исследование. Клинический материал засевают на кровяной агар и кровяно-телуритовий агар (или среда Клауберга ІІ), разлитые в чашки Петри. Кроме того, некоторые штаммы C.diphtheriae чувствительные к действию теллурита калию, потому их рост на телуритових средах может подавляться. Для выявления дифтерийного бактерионосительства посевы производят только на кровяно-телуритовий агар, поскольку в посевном материале может содержаться небольшое количество дифтерийных палочек, рост которых на неселективных средах будет подавляться другой микрофлорой. При этом допускается использование и транспортной среды.

Кровяно-теллуритовый агар.К 100 мл 2 % расплавленного и охлажденного 50 °С питательного агара рН 7,6 добавляют 10-15 мл дефибринованой крови и 2 мл 2 % раствора теллурита калию. Смесь тщательным образом перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри слоем толщиной 3-4 мм.

 У C. diphtheriae выделяют три биовара - gravis, mitis, intermedius

Бактерии биовара gravis - короткие, неправильной формы, с небольшим количеством метахроматических гранул.

Биовар mitis образует длинные согнутые полиморфные палочки, которые содержат много волютинових зерен (тельца Бебеша-Эрнста)

Бактерии биовара intermedius наиболее длинные с бочкообразными контурами, для них характерны поперечные перегородки, которые разделяют клетку на несколько сегментов. В настоящем биовар intermedius относят в группу gravis.

Среда Клауберга ІІ. К 100 мл 3 % питательного агара рН 7,6, расплавленного и охлажденного 50 °С, добавляют 3 мл 2 % раствора теллурита калия, 10 мл глицериновой смеси и 50 мл гемолизированной крови. Глицериновую смесь готовят путем добавления 20 мл стерильного глицерина до 40 мл дефибринованой крови. Смесь можно хранить в холодильнике на протяжении 4-х месяцев. Для приготовления гемолизированной ("лаковой") крови до 34 мл стерильной дистиллированной воды добавляют 16 мл дефибринованой крови.

Транспортная полужидкая среда. К 100 мл перевара Хоттингера или мясо-пептонного бульйона добавляют 1 г любого коммерческого агара, устанавливают рН 7,6, стерилизуют в автоклаве при 112 °С 30 хв, асептически добавляют 10 мл сыворотки и 1 мл 2 % теллурита калия. Среду разливают в пробирки по 5 мл. При возможности используют и более сложную транспортную среду ЕМЕС (AMIES), модифицировано Стюартом.

Посев от одного больного делают на одну чашку, используя при этом одну половину среды для посева из ротоглотки (миндалин, дужек, язычка), а вторую - для посева другим тампоном из носа. Если есть исследуемый материал из кожи, глаза, уха и других локализаций - добавляют еще одну чашку. Нельзя засевать материал от нескольких больных в одну чашку. Среды перед посевом согревают в термостате 15-20 мин. При посеве исследуемого материала его втирают тампоном сначала в отдельный участок кровяного агара площадью 2х1 см, потом аналогично на кровяно-телуритовом агаре (или среде Клауберга ІІ), при этом тампон все время вращают, чтобы засеять из него весь материал. Потом тем же тампоном штрихами засевают остальную поверхность среды (половину чашки). Такая техника посева позволяет получить изолированные колонии (чистую культуру), которые используют непосредственно из чашки для определения токсигенности и последующей их идентификации. Засеяные чашки или пробирки с транспортной средой инкубируют в термостате при 37 °С на протяжении 20-24 час.

На второй день с помощью стереоскопического микроскопа исследуют характер колоний. Если рост отсутствует на обеих средах делают повторный забор материала. Чашки с типичными и подозрительными на C.diphtheriae колониями отбирают для последующей идентификации культуры по всем тестам. Микроскопию подозрительных колоний можно и не проводить.

Культуральные свойства. Колонии дифтерийных палочек на кровяном агаре беловатого или желтоватого цвета, непрозрачные, круглой, слегка выпуклой формы, диаметром 1-2 мм Обычно они имеют маслянистую консистенцию, хотя некоторые могут образовывать хрупкие шереховатые R-колонии.

На кровяно-телуритовых средах колонии C.diphtheriae через 24 час роста имеют серый цвет, выпуклые, с ровным краем, вязкие. Через 48 год они приобретают темносерый или черный цвет с металлическим блеском, ровными или слегка фестончатыми краями, гладкой и блестящей или с радиально исчерченой поверхностью (R-формы), вязкие или хрупкие при прикосновении петлей. По структуре 48-часовых колоний на телуритовых средах и некоторыми ферментативными признаками возбудителя дифтерии разделяют на четыре культурально-биохимических варианта (биовары) - gravis, mitis, belfanti, intermedius.

Если типичный рост отсутствует, из других, сомнительных, колоний готовят мазки. При выявлении споровых палочек, коков, дрожжей и др., исследование на дифтерию прекращают и дают негативный ответ. Однако, важно помнить, что дифтерийные бактерии, которые образовали нетипичные колонии на средах с ингибиторами роста (теллурит калия), могут быть укорочены, утолщены, но сохраняют полиморфизм и характерное расположение.

При росте типичных колоний сразу же приступают к изучению их токсигенности и идентификации. Токсигенные свойства. Исследуют не меньше 2-х изолированных колоний путем посева одной половины каждой колонии на среду для определения токсигенности и непрожженной петлей на среду Пизу, а второй половины - на скошенный сывороточный агар для выделения чистой культуры и сохранения ее к окончанию лабораторной диагностики. В случае, если на чашке вырастают одновременно токсигенные и нетоксигенные разновидности C. diphtheriaе, необходимо при множественном росте подозрительных колоний исследовать токсигенные свойства около 20 колоний, засевая в одну бляшку материал из 5-6 колоний. При росте лишь одной колонии ее засевают на среду для определения токсигенности и, не прожаривая петлю, - в пробирку со средой Пизу. Если применяли транспортную среду высев из нее делают на плотные кровяно-телуритовые среды. На третий день при появлении специфических линий преципитации в агаровом геле и позитивной пробе на цистиназу выделенную культуру определяют как токсигенную С. diphtheriае. Если линии преципитации через 24 год отсутствуют, чашки инкубируют еще в течение суток. В случае негативной пробы Пизу культуру идентифицируют как другой вид коринебактерий. Чистую культуру на скошенном сывороточном агаре высевают на углеводородные среды с глюкозой, сахарозой, растворимым крахмалом, ставят пробы на выявление уреазы, пиразинамидазы и нитратнедуктазы.

На четвертый день делают учет результатов всех посевов и выдают аргументированный бактериологический вывод о выделенной культуре.

Реакция преципитации в геле  – проводится в чашках Петри или на предметных стеклах, куда помещают слой агарового геля. При застывании геля в нем вырезают лунки, в которые помещают антигены или антитела, или и то и другое. Различают 2 метода РП в геле:

а) метод простой (радиальной) иммунодиффузии: один из компонентов реакции иммунитета (антиген или антитело) помещают в лунку, а другой компонент – смешивают с агаром; при положительном результате(антиген соответствует антителу) вокруг лунки образуется кольцо преципитата;

б) метод двойной иммунодиффузии: и антитело и антиген помещают в отдельные лунки, они диффундируют в агаровом геле навстречу друг другу; при положительном результатена месте встрече антитела и антигена образуются линии преципитации.

Лечение.

  Специфическое: противодифтерийная сыворотка.

Неспецифическое: тетрациклин, пенициллин, диуретики, кардиотоники цефалоспорины.

Профилактика.

Специфическая: АКДС, АДС вакцины. Специфическая: санитарно-эпидемиологические мероприятия.

 

 

Коклюш, Паракоклюш

Токсономия.