Занятие № 7. «Ферментативный катализ»

 

ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ:

1. Механизм ферментного катализа. Фермент-субстратный комплекс. Каким образом ферменты снижают энергию активации химических реакций?

2. Механизмы регуляции ферментативной активности.

3. Коферменты, образующиеся из витаминов В₁, Н. Механизм действия ферментов карбоксилирования и декарбоксилирования.

4. Коферменты, образующиеся из витаминов В₂, В₅, липоевая кислота и их биохимическая роль. Механизм действия окислительно-восстановительных ферментов (оксидоредуктаз).

5. Коферменты, образующиеся из витаминов В₃, В₁₂, В₆, Вс и их биохимическая роль. Механизм действия ферментов трансфераз.

 

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

 

Практическое задание

Фосфатазы - ферменты, катализирующие гидролиз фосфорных эфиров. В частности, их субстратом является пара -нитрофенилфосфат (пНФФ):

Образующийся в результате реакции паранитрофенол в щелочной среде имеет желтую окраску. По интенсивности окраски раствора определяют количество образовавшегося продукта реакции. Используя эти данные, рассчитывают скорость ферментативной реакции.

 

a) Используя табличные данные, постройте график зависимости скорости ферментативной реакции, катализируемой фосфатазой, от концентрации субстрата. (Скорость реакции по вертикали, концентрация субстрата по горизонтали)

 

Концентрация субстрата, ммоль/дм^3	Скорость реакции, ммоль/(дм^3*мин)
0,5	8
1,0	15
2,0	28
3,0	35
4,0	38
5,0	40

 

Определите К_М (константу Михаэлиса) и V_max.

 

 

б) На основании данных о скорости ферментативной реакции при различных значениях рН, представленных в таблице, постройте график зависимости скорости ферментативной реакции от рН. (Скорость реакции по вертикали, значение рН по горизонтали)

 

 

рН	Скорость реакции, ммоль/(дм^3*мин)
4,1	15
4,5	35
5,0	55
5,5	60
6,0	61
6,5	50
7,0	35
7,5	25
8,0	20

 

Определите рН-оптимум фосфатазы.

 

 

в) Постройте график зависимости скорости ферментативной реакции от температуры. Данные о скорости ферментативной реакции при различных значениях температуры представлены в таблице. (Скорость реакции по вертикали, температура по горизонтали)

 

Температура, ^оС	Скорость реакции, ммоль/(дм^3*мин)
10	5
20	11
37	25
50	95
60	91
70	7,0
80	2,6

 

 

Определите температурный оптимум фосфатазы.

____________________________________________________________________________________________________________________________________

 

г) Конкурентным ингибитором фосфатаз является фосфат. Постройте графики зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в отсутствие и в присутствии фосфата. Данные представлены в таблице. (Скорость реакции по вертикали, концентрация субстрата по горизонтали, все в одном графике)

 

Концентрация субстрата, ммоль/дм^3	Скорость реакции в отсутствие ингибитора, ммоль/(дм^3*мин)	Скорость реакции в присутствии ингибитора, ммоль/(дм^3*мин)
0,5	8	4
1,0	15	7,5
2,0	28	14
3,0	35	17,5
4,0	38	19
5,0	40	20

 

 

Определите К_М и V_max ферментативной реакции в присутствии и в отсутствие конкурентного ингибитора. Сделайте вывод, каким образом фосфат влияет на эти показатели.

 

 

д) Фторид является неконкурентным ингибитором фосфатаз. Постройте графики зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в отсутствие и в присутствии фторида. Данные представлены в таблице. (Скорость реакции по вертикали, концентрация субстрата по горизонтали, все в одном графике)

 

 

Концентрация субстрата ммоль/дм^3	Скорость реакции в отсутствие ингибитора, ммоль/(дм^3*мин)	Скорость реакции в присутствии ингибитора, ммоль/(дм^3*мин)
0,5	8	5
1,0	15	10
2,0	28	18
3,0	35	24
4,0	38	30
5,0	40	35
6,0	-	38
8,0	-	40

 

 

Определите К_М и V_max ферментативной реакции в присутствии и в отсутствие конкурентного ингибитора. Сделайте вывод, каким образом фторид влияет на эти показатели.

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________