Техника окраски по методу Циля-Нельсена.

- нанести несколько капель карболового фуксина на фиксированный мазок, покрытый фильтровальной бумагой и подогреть до появления паров (3-5 мин);

- бумагу снять, мазок охладить и обесцветить 5% раствором серной кислоты и 3% раствором солянокислого спирта (2-4 с);

- тщательно промыть водой;

- окрасить синькой Леффлера (3-5 мин);

- промыть водой и высушить споры.

Кислотоустойчивые бактерии, в результате такой окраски становятся рубиново-красными, а все остальные – синими.

2. Приготовить мазок по методу Бурри-Гинса, промикроскопировать, зарисовать.

Многие виды микроорганизмов обладают способностью откладывать на поверхности своего тела мощный слизистый слой вокруг клеточной стенки, его называют капсулой. Капсулы имеют консистенцию геля, поэтому при микроскопии живых бактерий они видны очень плохо. Для их обнаружения применяют негативную окраску. При негативных способах краситель заполняет пространство вокруг бактерий, в результате чего они выглядят светлыми частицами на темном фоне.

Техника обнаружения капсул по методу Бурри-Гинса.

- приготовить тушевой препарат по Бурри (смешать каплю взвеси микробов с каплей туши и при помощи стекла со шлифованным краем приготовить мазок, как мазок из крови), затем высушить и зафиксировать (налить на поверхность мазка 96% спирт и поджечь);

- окрасить препарат водным фуксином (1-2 мин);

- промыть препарат водой, высушить на воздухе и микроскопировать.

Бактерии окрашиваются в красный цвет, неокрашенные капсулы выявляются на черно-розовом фоне.

Исследование микроорганизмов в живом состоянии.

В живом состоянии микроорганизмы исследуют с целью выявления их формы, подвижности и т.д.

3. Изучить нативные и окрашенные препараты, используя методы «раздавленной» или «висячей» капли.

Прижизненная (витальная) окраска.

Взвесь микроорганизмов вносят в каплю 0,001% раствора метиленового синего или нейтрального красного. Затем готовят препарат «раздавленная» или «висячая» капля и микроскопируют его.

Техника метода «раздавленной капли».

- на середину предметного стекла нанести петлей каплю исследуемого материала, накрыть ее покровным стеклом;

- рассмотреть в микроскопе с темным полем зрения, с объективом х40.

Техника метода «висячей капли».

- каплю исследуемого материала нанести на середину покровного стекла;

- быстро повернуть его каплей вниз и наложить на предметное стекло с углублением («лункой») в середине, причем капля должна свисать в углубление, не соприкасаясь с дном и краями;

- промикроскопировать.

 

Вопросы для обсуждения.

1. Постоянные и непостоянные структурные элементы микробной клетки. 2. Внутренние и поверхностные структурные элементы микробной клетки. 3. Строение и функции постоянных структурных элементов (нуклеоид, цитоплазма, цитоплазматическая мембрана, клеточная стенка, мезосомы, рибосомы). 4.  Дифференциация бактерий с помощью окраски по Граму. 5. Особенности строения клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. 6. Техника окраски микробов по Граму. 7. Отличительные признаки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. 8. Строение и функции непостоянных структурных элементов бактериальной клетки (капсула, споры, жгутики, включения, ворсинки). 9. Методы выявления непостоянных структурных элементов микробов: Шеффера-Фултона, Ожешко, Циля-Нильсена, Бури-Гинса, Нейссера. 10. Характеристика методов исследования микроорганизмов в живом состоянии. 11. Этапы методов «висячей» и «раздавленной» капли.     

Оформление лабораторной тетради.

    Переписать в тетрадь таб. 1; зарисовать микропрепараты из исследуемого материала с окраской по Грамму и Бури-Гинсу; зарисовать демонстрационные препараты.

 

Дополнительный материал.

Таблица 1

Отличительные признаки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов

№	Признак	Грамположительные микробы	Грамотрицательные микробы
1	Представители прокариот	1-шаровидные микробы; за исключением менингококков и гонококков; 2-дифтерийные палочки; 3-туберкулезные палочки; 4-спорообразующие палочки; 5-актиномицеты.	1-гонококки, менингококки; 2-палочковидные микробы; 3-риккетсии; 4-спирохеты; 5-микоплазмы.
2	Строение клеточной стенки (КС)	Однослойная клеточная стенка, состоящая из 6-8 рядов пептидогликана+полисахарид+ тейхоевые кислоты	Двухслойная клеточная стенка: внутренний слой – пептидогликан, наружный слой представлен комплексом липополисахаридов (ЛПС), фосфолипидов, белков и липопротеидов
3	Строение цитоплазматической мембраны (ЦПМ)	Не связана с КС, имеет многочисленные выросты в цитоплазму	Тесно связана с КС, имеет незначительное число выростов в цитоплазму
4	Особенности строения жгутикового аппарата	Одна пара колец для закрепления жгутиков на уровне ЦПМ	Две пары колец: одна расположена на уровне ЦПМ; вторая – на уровне КС
5	Спорообразование	да	Нет
6	Токсинообразование	Образуют экзотоксины	Образуют экзо- и эндотоксины (ЛПС)
7	Основные антигены	Тейхоевые кислоты	Соматический О-антиген (ЛПС)
8	Действие лизоцима	(+) образуют протопласты	(-), иногда (+), образуют сферопласты
9	Действие пенициллина	(+)	(-), иногда (+)

ЗАНЯТИЕ № 3