Унифицированный метод подсчета эритроцитов в счетной камере.

Счетные камеры – это приборы для подсчета форменных элементов крови, мочи и цереброспинальной жидкости, а также микроорганизмов (водорослей и т.д.). Счетные камеры представляют собой пластину из толстого стекла с углублением, на дне которого выгравирована счетная сетка. Углубление накрывают шлифованным покровным стеклом. Постоянная высота счетной камеры обеспечивается плотным притиранием покровного стекла к пластине до образования радужных ньютоновых колец. Счетная сетка состоит из больших и малых квадратов.

Существует много различных подсчетных сеток, но все они построены по одному принципу. Выделяют сетки различных типов – Тома, Бюркера, Предтеченского, Горяева, Фукса-Розенталя и др.; они различаются группировкой больших и малых квадратов. Сетки, выгравированные на пластинках камер. Площадь разделяется на большие квадраты, разделенные в свою очередь на различное количество малых квадратов, имеющих всегда одинаковую величину: стороны его равны 1/20 мм, высота всякой камеры равна 1/10 мм, таким образом, объем малого квадрата равен 1/4000 мм³ и является величиной постоянной для сеток всех систем. Высота камеры, площадь сетки и ее делений и разведение взятой для исследования крови позволяют подсчитать с помощью светового микроскопа количество форменных элементов крови (эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов) в определенном объеме (1 мкл) крови или другой среды.

Камера Фукс-Розенталя применяется для счета форменных элементов спинномозговой жидкости при лабораторных исследованиях спинномозговой жидкости. Сетка нанесена методом гравировки

Камера Нажотта. При высоте 0.05 см и площади 1 см² общий объем камеры равен 0.05 см³. Камера разделена продольными полосками на 40 секторов, каждый из которых имеет объем 1/800 см³. По мере увеличения плотности культур, в ходе опыта, может возникнуть необходимость разводить исходные суспензии в несколько раз в связи с тем, что наиболее надежные результаты подсчета в камере Нажотта получаются при титрах  водорослей в сотни и тысячи клеток в 1 мл. Конечные же численности на стационарной фазе у некоторых видов достигают десятков и сотен тысяч клеток в 1 мл. В аналитической химии титр – концентрация раствора, выраженная количеством (в граммах) растворённого вещества в 1 мл раствора или количеством какого-либо вещества, реагирующего с 1 мл данного раствора; титр бактерий – максимальное разведение водной взвеси бактерий, при посеве которой наблюдается их рост.

Камера Нойбауэра.

a. Камера подсчета, с сеткой Нейбауэра. Сетка для подсчёта клеток с двойной штриховкой. Градуируемая. Лунка глубиной 0,1 мм. Сетка подсчета с 9 большими квадратами, каждый 1 мм². Четыре больших квадрата по углам для подсчета лейкоцитов, каждый разделен на 16 квадратов с длиной сторон 0,25 мм. Большой квадрат в середине разделен на 25 квадратов с длиной сторон 0,2 мм. Каждый из них, в дальнейшем подразделяется на16 меньших квадратов со сторонами длиной 0,05 мм и площадью 0,0025 мм². Пять групп квадратов маркированных Е используются для подсчета тромбоцитов и эритроцитов. Все группы квадратов имеют тройные линии раздела с каждой стороны.

b. Камера подсчета с сеткой Нейбауэра со светящимися линиями. Сетка подсчета улучшенная Нейбауэром, но с родиевым покрытием основания камеры. Штрихи выгравированы внутри слоя родия и светятся под нормальной установкой микроскопа. При воздействии полярности можно изменять на противоположное изображение под микроскопом (штрихи светящимися или темными).

c. Камера подсчета Нейбауэра с двойной штриховкой. Градуируемая. Лунка глубиной 0,1 мм. Штриховка сетки улучшена Нейбауэром, но большой квадрат в центре разделен на 16 квадратов, каждый с длиной стороны 0,2 мм. Непохожая на большинство современных камер подсчета, площадь подсчета каждой группы квадрата ограничена крайней тройной линией.

Камера Тома используется только для подсчета тромбоцитов и эритроцитов. Имеет двойное сеточное деление, глубина ячейки 0,1 мм, Сеточное деление соответствует находящемуся в центре большому квадрату камеры  Нойбауэра

Счетная камера Бюркера. Прибор для визуального подсчета клеток крови, сперматозоидов и т.п. под микроскопом, представляющий собой предметное стекло с углублением для крови и нанесенной на него сеткой для подсчета форменных элементов в единице объема крови. Глубина камеры, 10 мкм, в 10 раз меньше глубины обычной камеры для подсчёта клеток крови. Это делает камеру Бюркера самой неглубокой из известных камер. Конструктивно камера состоит из 2-х частей, выполненных из плоского оптического стекла. Верхняя часть служит в качестве покровного стекла и имеет сетку в центре с ячейкой 1 кв.мм, разделенной на 100 квадратов площадью 0,1х0,1 мм.

Сетка Тюрка. Сетка типа Тюрка имеет 9 квадратов по 1 мм2. Находящийся в центре квадрат разделен на 16 средних и на 400 маленьких квадратов. Средние квадраты отделены между собой тройными линиями, 8 остальных площадей исчерчены проще. Каждый квадрат разделен на 16 больших квадратов. Вся сетка имеет 9X16=144 больших квадрата. Центральным квадратом пользуются для подсчета эритроцитов; остальные 8 квадратов служат для подсчета лейкоцитов.

Сетка Предтеченского. Сетка Предтеченского разделена на сто больших квадратов, различно исчерченных. Каждый большой квадрат содержит 16 малых.

Камера Горяева — приспособление, предназначенное для подсчета количества клеток в заданном объёме жидкости (рис. 23). Обычно ее используют для определения числа форменных элементов в образце крови. При помощи камеры Горяева возможно также определить увеличение микроскопа. Она используется для подсчёта количества клеток в культуре, предложена русским врачом, профессором Казанского университета Горяевым Н. К. (1875-1943).

 

Камера Горяева представляет собой прозрачный параллелепипед (предметное стекло), с бороздами и нанесённой микроскопической сеткой. Поперек основной пла­стинки проходят три возвышающиеся полоски, отделенные друг от друга же­лобками, а средняя полоска поперечным желобком разделена еще пополам. На каждой ее половинке выгравирована счетная сетка. Боковые полоски выше средней на 0,1 мм. При накладывании покровного стекла оно опирается на выступающие боковые полоски, а расстояние от сеток до покровного стекла ровно 0,1 мм. В результате объем жидкости над квадратом, образованным большими делениями сетки Горяева, составляет 0,004 микролитра. Для того чтобы это расстояние точно соответствовало расчетному, покровное стекло должно быть крепко прижато к подлежащей полоске. Это достигается притиранием. Точное количество крови равномерно смешивают в определенном количестве жидкости и помещают в камеру с известным объемом, в котором взвесь крови распределяется одним слоем.

Для подсчета эритроцитов в камере кровь разводят в 200 раз в 0,9% растворе хлорида натрия, для чего 0,02 мл крови вносят в предварительно отмеренные 4 мл разводящего раствора или пользуются смесителем. Взвесь тщательно перемешивают и затем заполняют счетную камера. Каплю разведенной крови вносят пипеткой под притертое покровное стекло камеры. Жидкость по капиллярам засасывается и заполняет пространство над сеткой. Подсчет проводят спустя 1 мин, когда эритроциты осядут на дно камеры.

 Камера Горяева состоит из 225 больших квадратов, 25 из которых разделены на малые, по 16 квадратов в каждом. Размеры малых делений клетки сетки составляют 0,05 мм, а больших – 0,2 мм. Подсчет эритроцитов производят в 5 больших квадратах, разделенные на малые. Глубина камеры равна 1/10 мм, сторона малого квадрата - 1/20 мм; таким образом, объём малого квадрата равен 1/4000 мм³. Чтобы не сбиться со счета, придерживаются определенной последовательности (рис. 24). Помимо находящихся внутри квадрата, считают все эритроциты, лежащие на двух линиях, например, на левой и верхней, и пропускают все лежащие на правой и нижней.

Подсчитав количество клеток над большим квадратом, можно подсчитать плотность данного типа клеток в суспензии по формуле: количество клеток/мл = количество клеток над большим квадратом ·2,5·10⁵

1. Используя камеру Горяева как своеобразный эталон можно определить увеличение микроскопа по формуле:

,

где K_G — это увеличение микроскопа; m₁ — положение левой границы клетки камеры Горяева; m₂ — положение правой границы клетки или группы клеток; N — количество клеток между измеряемыми границами; a — размер клетки камеры Горяева (равен 0,05 мм).

2. Количество эритроцитов в 1мкл крови рассчитывают по формуле

,

где х – количество эритроцитов в 1 мкл крови; а – число эритроцитов, сосчи­танных в определенном количестве малых квадратов;  – количество малых квадратов, в которых считались эритроциты; b – степень разведения крови; 1/4000 – объём малого квадрата (умножая его на 4000, приводим к объёму 1 мкл крови). При подсчете в пяти больших (80 малых) квадратах и при разведении крови в 200 раз количество эритроцитов в 1 мкл крови по данной формуле оказывается равным числу, умноженному на 10000. Подсчет эритроцитов в счетной камере достаточно точен (ошибка может достигать в среднем ± 2,5%).

Порядок выполнения работы:

1. При разведении крови 1:400, т. е. кровь разбавляют в 400 раз, в сухую чистую пробирку вносят 8 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида и капиллярной пипеткой 0,02 мл крови. Для разведения крови в 200 раз в 0,9% рас­твор хлорида натрия, 0,02 мл крови вносят в предварительно отме­ренные 4 мл разводящего раствора. Предварительно кончик пипетки вытирают фильтровальной бумагой или марлей, кровь выдувают на дно пробирки, а пипетку тщательно промывают верхним слоем жидкости повторно набирая ее и выдувая в пробирку.. При сгущении крови ее целесообразно разбавить в 500, 600, 700, 800 раз. Взвесь тща­тельно перемешивают и затем заполняют счетную камеру
2. Камера и покровное стекло должно быть вымыты и насухо вытерты. Покровное стекло притирают к камере так, чтобы появились радужные кольца. Берут каплю разведенной крови из пробирки и заполняют ею камеру, нанося к краю покровного стекла Эритроциты подсчитывают через 1 мин после заполнения камеры под малым увеличением микроскопа (объектив х8, окуляр х10 или х 15) с прикрытой диафрагмой или опущенным конденсатором (в затемненном поле зрения).
3. При накладывании покровного стекла оно опирается на выступающие боковые полоски (вы­ше средней на 0,1 мм), а расстояние от сеток до покровного стекла (т. е. глубина камеры) равно 0,1 мм. Для того, чтобы это расстояние точно соответствовало расчетному, покровное стекло должно быть крепко прижато к подлежащей полоске. Это достигается его притиранием. Каплю разведенной крови вносят пипеткой под притертое покровное стекло камеры, следя за тем, чтобы она равномерно без пузырьков воздуха заполнила всю поверхность камеры с сеткой, не затекая в бороздки. Жидкость по капиллярам засасывается и заполняет пространство над сеткой. Подсчет производят спустя 1 мин., когда эритроциты осядут на дно
4. Эритроциты подсчитывают в пяти больших (или 80 малых) квадратах, расположенных по диагонали. Учитывают эритроциты, лежащие внутри малого квадрата, а также на левой и верхней его стенках. Клетки, находящиеся на правой и нижней линиях квадрата, не считают.

Расчет: Подсчитанное число клеток в 80 малых квадратах умножают на 20 000 при разведении крови 1:400, на 25 000 при разведении 1:500 или на 30 000 при разведении 1:600 и получают окончательный результат в миллионах в 1 мкл. При этом исходят из того, что объем одного малого квадрата равен 1/4000 мкл. Для подсчета клеток в 1 л количество эритроцитов в 1 мкл еще умножают на 1 000 000.

Так, например, расчет количества эритроцитов в 1 мкл крови производят, исходя из разведения крови (в 200 раз), числа сосчитанных квадратов (80) и объема 1 малого квадрата (1/4000мкл), по следующей формуле: X=(a×4000×200)/80, где Х — число эритроцитов в 1 мкл крови: а — число сосчитанных эритроцитов. В результате сокращения Х=а×10000.

Примечание. Не допускается исследование крови со сгустками; подсчет клеток тотчас после заполнения камеры (не выжидая 1 мин); использование плохо вымытых и просушенных пипеток и пробирок, недоброкачественных реактивов, вызывающих гемолиз. При соблюдении всех правил подсчета ошибка составит в среднем ±2,5 %.

Правила дезинфекции

После использования камеру Горяева необходимо продезинфицировать 3% раствором перекиси водорода, промыть дистиллированной водой и вытереть мягкой салфеткой. Хранить камеру следует в сухом месте.