Органических кислот на липазу зародышей пшеницы

 

При исследовании воздействия смесей органических кислот А-D на липазу ЗП в реакционную среду, содержащую раствор фермента, 50 мМтрис/НСl буфер (рН 8,0), вносили поочередно смеси А-D до конечных концентраций 8, 20, 30 мМ/дм³. После внесения смесей органических кислот контролировали рН. Далее вносили субстрат – эмульсию триацилглицерида рафинированного подсолнечного масла. Активность липазы определяли при изменении концентрации масла в пределах 20-100 мМ/дм³, принимая молекулярную массу подсолнечного масла 913 Да. Реакционные среды инкубировали при постоянном перемешивании 30 мин при температуре 37 ^оС и определяли остаточную активность липазы [15, 251].

На рисунке 3.4 представлены результаты экспериментальных исследований зависимости скорости ферментативной реакции липазы от содержания субстрата в реакционных средах, включающих разное количество смесей А-D. Из рисунков следует, что композиции органических кислот снижают скорость реакции симбатно.

Рисунок 3.4. Влияние концентрации субстрата ([S], мМ/дм^3) на скорость ферментативной реакции липазы зародышей пшеницы (v, ед.) в присутствии смесей А (а), В (б), C (в), D (г), мМ/дм^3:1 – контроль; 2 - 8; 3 - 20; 4 – 30

Для выявления типа ингибирования, согласно методу Лайнуивера – Берка, были проанализированы функции 1/v и 1/[S], полученные по данным рисунка 3.4. (рисунок 3.5) [78, 88, 348].

На рисунках 3.5 (а-г) видно, что все графики могут иметь общую точку на оси абсцисс при интерполяции экспериментальных зависимостей в области отрицательных значений, а наклон графиков к оси абсцисс возрастает с увеличением концентрации смесей органических кислот, что свидетельствует о неконкурентном типе ингибирования.

 

Рисунок 3.5. Зависимость 1/v = f (1/[S]) для липазы зародышей пшеницы в присутствии смесей А (а), В (б), С (в), D (г), мМ/дм^3:1 – контроль; 2-8; 3-20; 4-30

Неконкурентный ингибитор подавляет каталитическое превращение субстрата в продукты реакции. При неконкурентном торможении ингибитор связывается с ферментом на участке, отличающемся от центра связывания субстрата; при этом он деформирует этот центр, подавляя его каталитическую функцию. Ингибитор связывается либо с ферментом, либо с комплексом фермент-субстрат. Другими словами, когда в реакционной среде находятся и субстрат и ингибитор, они присоединяются к ферменту одновременно, не конкурируют за один и тот же центр связывания.

Кинетическую характеристику процесса ингибирования оценивали по известному уравнению 3.2

,                       (3.2)

где v – скорость ферментативной реакции; K_i – константа равновесия системы фермент-ингибитор; [ S ] – концентрация субстрата; V – максимальная скорость ферментативной реакции; [I] – концентрация ингибитора; K_м – константа Михаэлиса, характеризующая химическое сродство фермента к субстрату.

Константа равновесия системы фермент-ингибитор K_iвычисляется по формуле

,                     (3.3)

В присутствии ингибитора константа Михаэлиса К_M не изменяется, а уменьшается в (1 + [I]/K_i) раз. К_M является характеристикой эффективности подавления активности фермента ингибитором: чем больше К_M, тем выше эффективность ингибирования. В присутствии смеси А эта константа составляет

В присутствии смесей В, С, D константы Михаэлиса имеют следующие значения, соответственно

Экспериментально доказано, что наибольшее ингибирующее действие на липазу ЗП оказывали композиционные смеси органических кислот В, D, наименьшее - смеси А, С [15, 251].